Cartographie Diffusion moléculaire dans la membrane plasmique par multiple-cible de Recherches (MTT)

Summary

Multiple-Cible Le traçage est un algorithme maison développé pour le suivi individuel au sein de molécules marquées de la membrane plasmique des cellules vivantes. Efficacement détecter, évaluer et le traçage des molécules au cours du temps à haute densité de fournir un outil convivial, outil exhaustif visant à étudier la dynamique des membranes nanométriques.

Abstract

Notre objectif est d'obtenir une description complète des processus moléculaires survenant au niveau des membranes cellulaires dans différentes fonctions biologiques. Nous visons à caractériser l'organisation complexe et dynamique de la membrane plasmique au niveau d'une seule molécule, en développant des outils d'analyse dédiés à une particule de suivi (SPT) à haute densité: Multiple-Cible Tracing (MTT) ^1. Simple-molécule vidéomicroscopie, offrant milliseconde et nanométrique résolution ^1-11, permet une représentation détaillée de ^12-14 organisation de la membrane par cartographier de façon précise des descripteurs tels que la localisation cellulaire des récepteurs, la mobilité, l'accouchement ou des interactions.

Nous avons revisité SPT, à la fois expérimentalement et algorithmiquement. Les aspects expérimentaux, dont l'optimisation de configuration et d'étiquetage des cellules, avec un accent particulier sur la densité pour atteindre l'étiquetage le plus élevé possible, afin de donner un aperçu dynamique de la dynamique moléculaires de las il se produit dans la membrane. Questions algorithmiques concernés chaque étape utilisée pour la reconstruction de trajectoires: la détection des pics, l'estimation et la reconnexion, abordés par des outils spécifiques de ^15,16 analyse d'image. La mise en œuvre de déflation après la détection permet pics sauvetage initialement masqué par des pics voisins, plus forts. Fait à noter, l'amélioration de la détection influe directement sur la reconnexion, en réduisant les écarts dans les trajectoires. Les performances ont été évaluées à l'aide de Monte-Carlo pour la densité de l'étiquetage différents et des valeurs de bruit, qui représentent généralement les deux limitations majeures pour les mesures parallèles à haute résolution spatiotemporelle.

La précision nanométrique ¹⁷ obtenues pour des molécules simples, en utilisant soit successives marche / arrêt optique photocommutation ou non linéaire, peut fournir des observations exhaustifs. C'est la base de méthodes nanoscopie ^{17 de} telle sorte que TEMPÊTE ^18, PALM ^{19,20, 21} ou RESOLFT STED ^22,23, which peut souvent exiger des échantillons d'imagerie fixes. La tâche essentielle est la détection et l'estimation de la diffraction limitée pics émanant de simples-molécules. Par conséquent, fournir des hypothèses adéquates telles que la manipulation une précision constante de position au lieu du mouvement brownien, le MTT est carrément adapté pour des analyses nanoscopiques. En outre, le MTT peut fondamentalement être utilisé à n'importe quelle échelle: non seulement pour les molécules, mais aussi pour les cellules ou les animaux, par exemple. Par conséquent, le MTT est un algorithme de suivi puissante qui trouve des applications à l'échelle moléculaire et cellulaire.

Protocol

Dans cette vidéo, nous présentons une pleine expérience unique de suivi des particules, en utilisant quantiques points destinés à un récepteur membranaire spécifique. L'objectif principal de cette expérience consiste à discriminer les différents types de comportements de diffusion moléculaire mesurées au sein de la membrane plasmique des cellules vivantes. En effet, les mouvements moléculaires qui se posent sur ​​la membrane peut généralement s'écarter de la diffusion brownienne en étant lin…

Discussion

Dans une particule de suivi, à côté des éléments de cellules et la microscopie, l'analyse représente une partie substantielle de l'ouvrage. Cela répond à l'algorithme utilisé pour effectuer les trois tâches principales: la détection, l'estimation et la reconnexion des pics sur chaque trame. Mais l'aspect conséquente de ce travail réside dans l'élaboration de l'algorithme lui-même, qui peut être adapté pour toute nouvelle enquête dédiée, essentiellement pour les dernières,…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)