מיפוי דיפוזיה מולקולרית בקרום פלזמה ידי מרובות יעד Tracing (MTT)

Summary

מרובה יעד האיתור הוא פיתח אלגוריתם ביתי למעקב אחר בנפרד מולקולות שכותרתו בתוך קרום הפלזמה של תאים חיים. יעיל באיתור, הערכה ואיתור מולקולות לאורך זמן בצפיפות גבוהה לספק ידידותי למשתמש, כלי מקיף לחקור הדינמיקה קרום ננומטריים.

Abstract

המטרה שלנו היא לקבל תיאור מקיף של התהליכים המולקולריים המתרחשים קרומים תאיים על תפקודים ביולוגיים שונים. מטרתנו המאפיינת את הארגון מורכב הדינמיקה של קרום הפלזמה ברמת מולקולה בודדת, על ידי פיתוח כלים אנליטיים ייעודיים למעקב בודד החלקיקים (SPT) בצפיפות גבוהה: מרובות יעד Tracing (MTT) ^1. מולקולה בודדת videomicroscopy, מציע אלפית השנייה ו ננומטריים ברזולוציה ^1-11, מאפשר ייצוג מפורט של הארגון קרום ^12-14 על ידי מיפוי מדויק מתארי כגון קולטנים לוקליזציה תא הכליאה, ניידות או אינטראקציות.

אנחנו וביקרה SPT, הן בניסוי ו אלגוריתמית. היבטים הניסוי כללו אופטימיזציה של ההתקנה וסימון התא, עם דגש מיוחד על הגעה צפיפות תיוג הגבוהה ביותר האפשרית, על מנת לספק תמונת מצב דינמית של דינמיקה מולקולריתזהו זה מתרחש בתוך הממברנה. בעיות אלגוריתמיות מודאג כל צעד המשמש מחדש מסלולים: איתור פסגות, האמידה המחודש, לטפל על ידי כלים מסוימים מתוך ניתוח התמונה ^15,16. יישום דפלציה לאחר זיהוי מאפשר פסגות הצלת מוסתר בתחילה, פסגות שכנות חזקות יותר. יש לציין, שיפור זיהוי ישירות על חיבור מחדש, על ידי צמצום הפערים בתוך מסלולים. הופעות הוערכו באמצעות סימולציות מונטה קרלו עבור צפיפות תיוג ערכי רעש שונים, אשר בדרך כלל מייצגים את שתי המגבלות העיקריות מדידות מקבילות ברזולוציה גבוהה spatiotemporal.

דיוק ננומטריים ¹⁷ השיג עבור מולקולות בודדות, באף אחת ברציפות on / off אופטיקה photoswitching או שאינו ליניארי, יכול לספק תצפיות ממצה. זהו הבסיס של שיטות nanoscopy ¹⁷ כמו ¹⁸ STORM, פאלם ^{19,20, 21} או RESOLFT STED ^22,23, WHIפרק עשוי לעיתים קרובות דורשים דגימות הדמיה קבועים. המשימה המרכזית היא זיהוי והערכה של דיפרקציה מוגבלים פסגות הנובעות מולקולות בודדות. לפיכך, מתן הנחות הולמים כגון טיפול דיוק מיקומית קבוע במקום התנועה הבראונית, MTT מתאים בצורה ישירה עבור ניתוחים הננוסקופי. יתר על כן, MTT יכול ביסודו לשמש בכל קנה מידה: לא רק מולקולות, אלא גם על תאים או על בעלי חיים, למשל. לפיכך, MTT הוא אלגוריתם מעקב רב עוצמה מוצא יישומים בקני מידה מולקולרית תאית.

Protocol

בסרטון הזה, אנו מציגים מעקב מלא יחיד ניסוי החלקיקים, באמצעות הקוונטים נקודות ממוקדות לקולטן בקרום מסוים. המטרה העיקרית של ניסוי זה מורכב מסוגים שונים של התנהגויות להפלות דיפוזיה מולקולרית שנמדדו בתוך הממברנה של תאים חיים. ואכן, תנועות מולקולריים הנובעים על הממברנה ?…

Discussion

במעקב אחר חלקיק יחיד, לצד ההיבטים התא במיקרוסקופ, ניתוח מייצג חלק ניכר של העבודה. זה פותר את האלגוריתם המשמש לביצוע שלוש משימות עיקריות: איתור, הערכה וחיבור מחדש פסגות על כל מסגרת. אבל היבט הסוגר של עבודה זו מתגורר לפרט את האלגוריתם עצמו, ייתכן שיהיה צורך להתאים עבור כ?…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Quantity
Cos-7 cell line	ATCC	CRL-1651	5,000 cells/well
HBSS without Ca2+	GIBCO	14175	1 ml
0.05% Trypsin EDTA	GIBCO	25300	1 ml
8-well Lab-tek	NUNC	155441	1
QDot-605 streptavidin	Invitrogen	Q10101MP	20 mM
Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21)
Fab from mAb 108	ATCC	HB-9764	200 μg
NHS-Biotin	Thermo Scientific	21435	18.5 μg
Complete medium
DMEM	GIBCO	41965	500 ml
Fetal Bovine Serum	SIGMA	F7524	50 ml
L-Glutamine	GIBCO	25030	5 ml
HEPES	GIBCO	15630	5 ml
Sodium Pyruvate	GIBCO	11360	5 ml
Imaging medium
HBSS with Ca2+	GIBCO	14025	25 ml
HEPES	GIBCO	15630	250 μl

 

Equipment	Company	Reference
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000U
Fluorescent lamp	Nikon	Intensilight C-HGFIE
1.3 NA 100x objective	Nikon	Plan Fluor 1.30
1.49 NA 100x objective	Nikon	APO TIRF 1.49
Camera	Roper Scientific	Cascade 512 B
Thermostated box	Life Imaging Services	The Box

Appendix: example Script of MTT supplementary analysis

function MTT_example(file_name)
%%% Basic examples showing how to recover MTT output results
%%% to plot each trace and to build the histogram
%%% of fluorescence intensities

if nargin<1 % no file_name provided?
    files = dir(‘*.stk’);
    if isempty(files), disp(‘no data in current dir’), return, end
    file_name = files(1).name; % default: first stk file
    disp([‘using’ file_name ‘by default’])
end

file_param = [file_name ‘_tab_param.dat’]; % output file

%% Load data
cd(‘output23′) % or (‘output22’), according to version used
% Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters,
% an extra parameter, noise, was added in version 2.3

% To read all parameters at once, in a single table
% tab_param = fread_all_param(file_param);
% tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = …

% To read all parameters (except frame_number) in separate tables
% [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param);

tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded!
tab_j= fread_data_spt(file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8);

%% Loop over traces
N_traces = size(tab_i,1);
% Tables are N_traces lines by N_frames colums

for itrc = 1:N_traces
    No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only
     plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index))
    xlabel(‘i (pixel)’), ylabel(‘j (pixel)’)
    title([‘trace # ‘ num2str(itrc)])
    disp(‘Please strike any key for next trace’), pause
end

%% Fluo histogram
N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only
hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins
xlabel(‘intensity (a.u.)’), ylabel(‘occurrence’)
title(‘histogram of particles fluorescence intensity’)