إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا
Summary
تفاصيل هذا العمل في إعداد الليفين 3D الاطر لزراعة الخلايا الجذعية والتمييز plutipotent. ويمكن استخدام مثل هذه السقالات لفحص آثار المركبات البيولوجية المختلفة على سلوك الخلايا الجذعية كذلك بصيغته المعدلة لاحتواء نظم لتقديم الأدوية.
Abstract
تم العثور على خلايا جذعية في طبيعيا microenvironments 3D في الجسم الحي، والتي غالبا ما يشار الى جذع الخلية المتخصصة 1. زراعة الخلايا الجذعية داخل السقالات مادة بيولوجية 3D يوفر وسيلة لتحاكي بدقة هذه microenvironments، وتوفير ميزة على الطرق التقليدية لثقافة 2D باستخدام البوليسترين، فضلا عن طريقة لاستبدال الأنسجة الهندسة 2. في حين تم استخدام 2D polystrene زراعة الأنسجة لغالبية تجارب زراعة الخلايا، ويمكن 3D السقالات مادة بيولوجية عن كثب تكرار microenvironments وجدت في الجسم الحي من خلال تمكين إنشاء أكثر دقة للقطبية الخلية في البيئة والتي تمتلك الخصائص البيوكيميائية والميكانيكية مماثلة إلى الأنسجة اللينة. (3) ومجموعة متنوعة من مشتقة بشكل طبيعي وجرى التحقيق الاصطناعية السقالات مادة بيولوجية كما بيئات 3D لدعم نمو الخلايا الجذعية. بينما يمكن توليفها السقالات الاصطناعية لديها أكبر Rأنج من الخواص الميكانيكية والكيميائية وغالبا ما يكون أكبر استنساخ، وتتكون غالبا الحيوية الطبيعية من البروتينات والسكريات الموجودة في مصفوفة extracelluar ونتيجة لذلك تحتوي على مواقع الربط للالتصاق الخلايا ودعم ثقافة الخلية بسهولة. وقد تم الليفين السقالات، التي تنتجها البلمره والفيبرينوجين بروتين تم الحصول عليها من البلازما، والتحقيق فيها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من تطبيقات هندسة الأنسجة على حد سواء في التجارب المختبرية والحية 4. ويمكن تعديل هذه السقالات باستخدام مجموعة متنوعة من وسائل لدمج أنظمة إطلاق للرقابة لتوفير العوامل العلاجية 5. وقد أظهرت الأعمال السابقة التي يمكن أن تستخدم مثل هذه السقالات للخلايا الجذعية الجنينية ثقافة بنجاح، ويمكن استخدامها لهذا النظام القائم على ثقافة سقالة لفحص الآثار المترتبة على عوامل النمو المختلفة على تمايز الخلايا الجذعية داخل المصنف 6،7.
هذه تفاصيل بروتوكول عملية polymerizinز الليفين السقالات من الحلول الفيزيولوجية باستخدام النشاط الأنزيمي من ثرومبين. تستغرق العملية 2 أيام لاستكمال، بما في ذلك خطوة لغسيل الكلى بين عشية وضحاها من أجل حل الفيزيولوجية لإزالة citrates التي تمنع البلمرة. هذه الأساليب مفصلة تعتمد على تركيز الفيبرينوجين مصممة على أن تكون الأمثل لالجنينية الجذعية المحفزة التي يسببها وثقافة الخلية. حققت الجماعات الأخرى مزيد من السقالات الليفين لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا والتطبيقات – مما يدل على براعة هذا النهج 8-12.
Protocol
Discussion
هذا البروتوكول المفصلة أعلاه يوفر طريقة لتوليد 3D السقالات الليفين للالجذعية المحفزة ثقافة الخلية، وتحديدا لالجنينية الماوس والناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة. هذه مادة بيولوجية 3D نظام يستند إلى ثقافة أكثر دقة يقلد محراب الخلايا الجذعية الموجودة في الجسم الحي،</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب يود أن يقر NSERC ديسكفري جرانت 402462 "السقالات الأنسجة المهندسة لمراقبة السلوك الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
