הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות
Summary
זה מפרט עבודה והכנת 3D הפיברין פיגומים culturing ומבדל בתאי גזע plutipotent. פיגומים אלה ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של חומרים ביולוגיים שונים על התנהגות בתאי גזע גם שונה כדי לכלול מערכות אספקת סמים.
Abstract
בתאי גזע נמצאים באופן טבעי microenvironments 3D in vivo, אשר המכונה לעתים קרובות נישה תא גזע 1. גזע culturing בתוך תאים של 3D ביולוגי פיגומים מספק דרך לחקות במדויק את microenvironments, מתן יתרון על פני שיטות מסורתיות תרבות 2 ד באמצעות קלקר, כמו גם שיטה להחלפת רקמות הנדסה 2. בעוד polystrene 2 ד תרביות רקמה שימש במשך רוב הניסויים תרבית תאים, 3D פיגומים ביולוגי יכול הדוק יותר לשכפל את microenvironments נמצאו in vivo, בכך שהיא מאפשרת הקמת מדויק יותר של הקוטביות בתא בסביבה ובעל תכונות ביוכימיות ומכניות הדומות רקמות רכות. 3 מגוון של נגזרים באופן טבעי סינתטי פיגומים ביולוגי נחקרו כמו 3D סביבות לתמיכה תא גידול גזע. בעוד פיגומים סינתטי יכול להיות מסונתז יש R יותרange של תכונות מכניות וכימיות, ולעתים קרובות יש שחזור גדול, biomaterials טבעיים מורכבים לרוב חלבונים ופוליסכרידים שנמצאו מטריקס extracelluar וכתוצאה מכך מכילים אתרי קישור הידבקות התא בקלות לתמוך תרבית תאים. הפיברין פיגומים, המיוצר על ידי polymerizing פיברינוגן חלבון המתקבל פלזמה, נחקרו נרחב עבור מגוון רחב של יישומים הנדסיים רקמות הן במבחנה in vivo 4. פיגומים אלו ניתן לשנות באמצעות מגוון של שיטות לשלב מערכות שחרור מבוקר עבור אספקת גורמים טיפוליים 5. מחקרים קודמים הראו כי פיגומים כאלה יכולים לשמש בהצלחה בתאי גזע עובריים תרבות וזה פיגום מערכת מבוססת התרבות ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של גורמי גדילה שונים על התמיינות של תאים שנזרעו בתוך גזע 6,7.
פרוטוקול זה מפרט את תהליך polymerizinגרם הפיברין ויוצר תשתית מפתרונות פיברינוגן באמצעות הפעילות האנזימטית של תרומבין. התהליך לוקח 2 ימים לסיים, כולל צעד דיאליזה לילה לפתרון פיברינוגן להסיר citrates המעכבות פילמור. שיטות אלו מפורטות להסתמך על ריכוזי פיברינוגן נחוש בדעתו להיות אופטימלי עבור העובר המושרה תרבות גזע pluripotent התא. קבוצות אחרות חקרו יותר פיגומים הפיברין למגוון רחב של סוגי תאים ויישומים – הוכחת צדדיות של גישה זו 8-12.
Protocol
Discussion
זה פרוטוקול כמפורט לעיל מספק שיטה להפקת 3D פיגומים הפיברין לתרבות גזע pluripotent התא, במיוחד עבור עכבר עובריים המושרה בתאי גזע pluripotent. זו מערכת ביולוגי מבוסס 3D התרבות באופן מדויק יותר מחקה את תא גזע נישה למצוא vivo וכתוצאה מכך, הוא יכול לשמש מסך אותות ביולוגיים כדי לקבוע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר NSERC דיסקברי גרנט 402462 "פיגומים רקמות מהונדסות לשליטה pluripotent המושרה גזע התנהגות התא".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O’Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
