Préparation de la 3D pour les applications de fibrine Échafaudages CULTURE DE CELLULES SOUCHES
Summary
Cet ouvrage détaille la préparation de la 3D de fibrine échafaudages pour la culture et la différenciation des cellules souches plutipotent. Ces échafaudages peuvent être utilisés pour cribler les effets de divers composés biologiques sur le comportement des cellules souches ainsi que modifié pour contenir des systèmes de délivrance de médicaments.
Abstract
Les cellules souches se trouvent dans naturellement microenvironnements 3D in vivo, qui sont souvent appelés la niche de cellules souches 1. Culture de cellules souches à l'intérieur de la 3D échafaudages biomatériau offre un moyen de précision imiter ces microenvironnements, fournissant un avantage sur les méthodes traditionnelles de culture 2D à l'aide de polystyrène ainsi que d'une méthode pour les tissus de remplacement d'ingénierie 2. Alors que la culture de tissus 2D polystyrène a été utilisé pour la majorité des expériences de culture cellulaire, des matrices 3D biomatériaux peuvent plus étroitement reproduire les micro-environnements trouvés in vivo, en permettant l'établissement plus précis de la polarité cellulaire dans l'environnement et possédant des propriétés biochimiques et mécaniques similaires aux tissus mous. 3 Une variété de dérivés naturels et synthétiques échafaudages de biomatériaux ont été étudiés comme des environnements 3D pour soutenir la croissance sur les cellules souches. Alors que les échafaudages synthétiques peuvent être synthétisés à avoir une plus grande range de propriétés mécaniques et chimiques et ont souvent une plus grande reproductibilité, biomatériaux naturels sont souvent composés de protéines et de polysaccharides présents dans la matrice extracellulaire et par conséquent contenir des sites de liaison pour l'adhésion cellulaire et facilement soutenir la culture cellulaire. Échafaudages de fibrine, produite par la polymérisation du fibrinogène protéine obtenue à partir de plasma, ont été largement étudiés pour une grande variété d'applications d'ingénierie tissulaire à la fois in vitro et in vivo 4. Ces échafaudages peuvent être modifiés en utilisant une variété de méthodes permettant d'intégrer les systèmes de libération contrôlée de la prestation des facteurs thérapeutiques 5. Des travaux antérieurs ont montré que ces échafaudages peuvent être utilisés avec succès des cellules souches embryonnaires et la culture ce système de culture basé sur échafaudage peut être utilisé pour cribler les effets de divers facteurs de croissance sur la différenciation des cellules souches ensemencées à l'intérieur de 6,7.
Ce protocole décrit le processus de polymerizing de fibrine à partir de solutions de fibrinogène échafaudages aide de l'activité enzymatique de la thrombine. Le processus prend 2 jours pour compléter, y compris une étape de dialyse de nuit pour la solution de fibrinogène pour enlever les citrates qui inhibent la polymérisation. Ces méthodes détaillées s'appuient sur les concentrations de fibrinogène jugées optimales pour la culture de cellules embryonnaires pluripotentes induites et la tige. D'autres groupes ont en outre étudié les échafaudages de fibrine pour un large éventail de types de cellules et des applications – démontrant la polyvalence de cette approche 8-12.
Protocol
Discussion
Ce protocole détaillé ci-dessus fournit une méthode pour générer des matrices 3D de fibrine pour la culture de cellules souches pluripotentes, spécialement pour les embryonnaire de la souris et cellules souches pluripotentes induites. Ce système 3D biomatériau culture fondée sur plus de précision imite la niche de cellules souches in vivo et ont trouvé, par conséquent, il peut être utilisé pour cribler des indices biologiques afin de déterminer leurs effets sur la différenciation des cellules so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier découverte du CRSNG 402462 "échafaudages ingénierie tissulaire pour contrôler les comportements induits par les cellules souches pluripotentes".
Materials
Equipment needed:
Analytical balance
pH meter
Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2)
Stir plate
Spectrophotometer
Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen)
50 mM calcium chloride solution
Sterile conical tubes (15 or 50 mL)
35 mm Petri dishes
Dialysis tubing (7,000 MW cutoff)
Dialysis clips
5.0 μm syringe filters
Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters
Syringe
24 well tissue culture plates
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma | T7009 |
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