Ex vivo Mimetismo de normal e anormal Hematopoese Humanos
Summary
Um sistema de cultura de 3D para a hematopoiese é descrito usando sangue do cordão umbilical humano e células de medula óssea leucémicas. O método baseia-se na utilização de um poliuretano poroso sintético andaime revestido com proteínas da matriz extracelular. Este andaime é adaptável para acomodar uma grande variedade de células.
Abstract
Células-tronco hematopoéticas requer um microambiente único, a fim de sustentar a formação do sangue célula 1, a medula óssea (BM) é um complexo tridimensional (3D) tecido hematopoiese em que é regulada por espacialmente organizadas microambientes celulares denominados nichos 2-4. A organização dos nichos BM é crítico para a função ou disfunção de BM normal ou maligno 5. Por conseguinte, uma melhor compreensão do microambiente em in vivo utilizando um mimetismo ex vivo nos ajudaria elucidar os determinantes moleculares, celulares e microambiental de leucemogênese 6.
Actualmente, as células hematopoiéticas são cultivadas in vitro em frascos de tecidos bidimensionais (2D) de cultura / poço de placas 7 que requerem ou de co-cultura com alogénico ou xenogénica células estromais ou adição de citocinas exógenas 8. Estas condições são artificiais e diferem do in vivo </em> microambiente na medida em que faltam os nichos 3D celulares e expor as células a concentrações anormalmente elevados de citocinas que podem resultar em diferenciação e perda de 9,10 pluripotência.
Aqui, apresentamos um romance 3D osso sistema de cultura de medula que simula o ambiente de crescimento in vivo em 3D e suporta hematopoiese multilinhagens na ausência de fatores de crescimento exógenos. O andaime altamente poroso utilizado neste sistema de poliuretano (PU), facilita a alta densidade crescimento celular através de uma maior área superficial específica do que a cultura em monocamada em 2D convencional 11. O nosso trabalho indicou que este modelo de suporte o crescimento de sangue do cordão umbilical humano (CB), as células mononucleares (MNC) 12 e primárias de células leucémicas, na ausência de citocinas exógenas. Este mimetismo 3D romance proporciona uma plataforma viável para o desenvolvimento de um modelo humano experimental para estudar a hematopoiese e para explorar novos tratamentos para a leucemia.
Protocol
Discussion
O ex vivo sistema de cultura 3D apresentado aqui permite-nos estabelecer uma biomimicry 3D da hematopoiese que recapitula a arquitetura original BM e fenótipo celular independente de citocinas exógenas. O modelo 3D fornece a estrutura e do microambiente que permite normais e anormais células hematopoiéticas para proliferar em condições similares àquelas encontradas in vivo.
A seleção do material polimérico andaime representou um passo crítico no projeto biomimicr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Fundo Thomas Richard leucemia, a Senhora Tata Memorial Trust, do Northwick Park Hospital Fundo Fiduciário Leucemia Research e do Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde (NIHR), Reino Unido.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
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