Ex vivo Mimicry van normale en abnormale Human Haematopoiese
Summary
Een 3D cultuur voor hematopoiesis beschreven met menselijke navelstrengbloed en leukemische beenmergcellen. De methode is gebaseerd op het gebruik van een poreuze kunststof polyurethaan scaffold bekleed met extracellulaire matrix. Deze steiger is aanpasbaar aan een groot aantal cellen te passen.
Abstract
Hematopoietische stamcellen dat er een unieke micro-omgeving om bloedcel vorming van een te ondersteunen; het beenmerg (BM) is een complexe driedimensionale (3D) weefsel waarin hematopoiese wordt geregeld met behulp van ruimtelijk georganiseerd cellulaire micro-omgevingen genoemd niches 2-4. De organisatie van de BM niches is van cruciaal belang voor de functie of disfunctie van normale of kwaadaardige BM 5. Daarom is een beter begrip van de in vivo micro-omgeving met behulp van een ex vivo mimicry zou ons helpen ophelderen van de moleculaire, cellulaire en microenvironmental determinanten van leukemogenese 6.
Op dit moment zijn hematopoietische cellen gekweekt in vitro in twee-dimensionale (2D) weefselkweekflessen / well-platen 7 tot hetzij co-cultuur met allogene of xenogene stromale cellen of toevoeging van exogene cytokines 8. Deze voorwaarden zijn kunstmatige en verschillen van de in vivo </em> micro omdat zij niet de 3D cellulaire nissen wordt blootgesteld cellen abnormaal hoge concentraties cytokine die kan leiden tot verlies van differentiatie en pluripotentie 9,10.
Hierin stellen we een nieuw 3D beenmerg teeltsysteem de simuleert in vivo 3D groeiomstandigheden en ondersteunt multilineaire hematopoiesis in afwezigheid van exogene groeifactoren. De sterk poreuze in dit systeem uit polyurethaan (PU) maakt een hoge dichtheid celgroei in een hoger specifiek oppervlak dan de conventionele monolaagkweek in 2D 11. De werk heeft aangetoond dat deze model de groei van menselijke navelstrengbloed (CB) mononucleaire cellen (MNC) 12 en primaire leukemische cellen in de afwezigheid van exogene cytokines ondersteund. Deze nieuwe 3D-mimicry biedt een levensvatbaar platform voor de ontwikkeling van een menselijk experimenteel model om hematopoiese te bestuderen en om nieuwe behandelingen voor leukemie te ontdekken.
Protocol
Discussion
De ex vivo 3D-cultuur systeem hier gepresenteerde stelt ons in staat om een 3D-biomimicry van hematopoiese dat recapituleert de originele BM architectuur en cellulaire fenotype onafhankelijk van exogene cytokines. De 3D-model biedt de structuur en de micro waarmee normale en abnormale hematopoïetische cellen prolifereren omstandigheden vergelijkbaar met die aangetroffen in vivo.
De selectie van het polymère steigermateriaal betekende een belangrijke stap in de biomimicry …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Richard Thomas Leukemie Fonds, de Vrouwe Tata Memorial Trust, het Northwick Park Hospital Leukemie Research Trust Fund en het National Institute of Health Research (NIHR), Verenigd Koninkrijk.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue No |
| Dioxan | Invitrogen | D20,186-3 |
| PBS | Gibco | 14190-094 |
| IMDM | Invitrogen | 12440-053 |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 |
| MTS | Promega | G3580 |
| Glutaraldehyde | Fluka Biochemika | 49624 |
| Wright-Giemsa | Sigma-Aldrich | WG32 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10108-165 |
| CD71 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32272 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 |
| CD45-FITC | BD Pharmigen | 74895 |
| CD71-PE | BD Pharmigen | 555537 |
| CD235a-PE-Cy5 | BD Pharmigen | 555570 |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S-8032 |
References
- Orkin, S., Zon, L. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Spradling, A., Drummond-Barbosa, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. J Biosci. Bioeng. 100, 28-35 (2005).
- Lo Celso, C. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Mantalaris, A., Bourne, P., Wu, J. Production of human osteoclasts in a three-dimensional bone marrow culture system. Biochem. Eng. J. 20, 189-196 (2004).
- Placzek, M. Stem cell bioprocessing: fundamentals and principles. J. R. Soc. Interface. 6, 209-232 (2009).
- Dexter, T., Testa, N., Prescott, D. . Methods in Cell Biology. 14, 387-405 (1976).
- Piacibello, W. Differential growth factor requirement of primitive cord blood hematopoietic stem cell for self-renewal and amplification vs proliferation and differentiation. Leukemia. 12, 718-727 (1998).
- Yoshida, T., Takagi, M. Cell processing engineering for ex vivo expansion of hematopoietic cells: a review. Biochemical Engineering Journal. 20, 99-106 (2004).
- Lim, M. Intelligent bioprocessing for haemotopoietic cell cultures using monitoring and design of experiments. Biotechnol. Adv. 25, 353-368 (2007).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Panoskaltsis, N. The development of a three-dimensional scaffold for ex vivo biomimicry of human acute myeloid leukaemia. Biomaterials. 31, 2243-2251 (2010).
- Mortera-Blanco, T., Mantalaris, A., Bismarck, A., Aqel, N., Panoskaltsis, N. Long-term cytokine-free expansion of cord blood mononuclear cells in three-dimensional scaffolds. Biomaterials. 32, 9263-9270 (2011).
- Safinia, L., Datan, N., Hohse, M., Mantalaris, A., Bismarck, A. Towards a methodology for the effective surface modification of porous polymer scaffolds. Biomaterials. 26, 7537-7547 (2005).
