Indução de Infarto do Miocárdio em Zebrafish adultos usando Cryoinjury

Summary

Zebrafish representa um modelo útil para estudar os mecanismos de regeneração do coração nos vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para a indução de um infarto do coração em adultos usando cryoinjury zebrafish. Este método resulta em morte celular maciça dentro de 20% da parede ventricular, semelhantes às observadas em infartos de mamíferos.

Abstract

O coração de mamífero é incapaz de regeneração significativa na sequência de uma lesão aguda, tais como enfarte do miocárdio ^1. Em contraste, urodele anfíbios e peixes teleósteos reter uma notável capacidade para a regeneração cardíaca com pouca ou nenhuma cicatriz ao longo da vida ^2,3. Não se sabe porque apenas alguns vertebrados não-mamíferos pode recriar um órgão completo a partir de tecidos remanescentes ^4,5. Para entender as diferenças moleculares e celulares entre as respostas regenerativas em espécies diferentes, é preciso usar abordagens semelhantes para induzir lesões agudas.

Nos mamíferos, o modelo mais utilizado para estudar reparação cardíaca tem sido isquemia aguda após a ligadura da artéria coronária ou destruição do tecido após cryoinjury ^6,7. A regeneração cardíaca em salamandras e peixes-zebra tem sido predominantemente estudada após uma ressecção parcial do ventrículo ápice ^2,3. Recentemente, vários grupos têm establtada a técnica cryoinjury em ^8-10 peixe-zebra adultos. Este método tem um grande potencial porque permite uma discussão comparativo dos resultados obtidos a partir das espécies de mamíferos e não mamíferos.

Aqui, nós apresentamos um método para induzir um enfarte em forma de disco reprodutível do ventrículo peixe-zebra por cryoinjury. Este modelo de lesão é baseada sobre o tecido de congelamento-descongelamento rápido, o que resulta na morte da célula maciça de cerca de 20% de cardiomiócitos da parede ventricular. Primeiro, uma pequena incisão foi feita através do peito com uma tesoura iridectomia para acessar o coração. A parede ventricular foi congelado diretamente através da aplicação de 23-25 ​​segundos, uma criossonda aço inoxidável pré-arrefecido em azoto líquido. Para parar o congelamento da água de peixe coração, à temperatura ambiente foi lançada sobre a ponta do criossonda. O procedimento é bem tolerado pelos animais, com uma taxa de sobrevivência de 95%.

Para caracterizar o processo regenerativo, os corações foramcoletados e fixados em diferentes dias após cryoinjury. Posteriormente, a amostra foram incorporadas para cryosectioning. As lâminas com secções foram processadas para análise histológica, hibridação in situ e imunofluorescência. Esta empresa aumenta a nossa compreensão dos fatores que são necessários para a plasticidade regenerativa no peixe-zebra, e fornecer novos insights sobre os mecanismos de regeneração cardíaca. Um entendimento conceitual e molecular da regeneração cardíaca em zebrafish afetará tanto a biologia do desenvolvimento e da medicina regenerativa.

Protocol

1. Equipamento Set-up A principal ferramenta usada para executar cryoinjury é o cryoprobe, o instrumento pen-like que é feita de aço inoxidável (Figura 1A). O identificador cilíndrica é de 40 mm de comprimento e tem um diâmetro de 8 mm. A ponta do aplicador é de 6 mm de comprimento e 0,8 mm de diâmetro. A junção entre a ponta eo identificador é cónica 4 mm de comprimento. Além disso, o identificador do cryoprobe deve ser isolado com um tubo de plástico e fita para evitar o congelamento dos dedos enquanto mantém a ferramenta durante o procedimento. Outros materiais que são necessários para a criocirurgia são um estereomicroscópio, fórceps afiadas, micro tesoura de mola de dissecação e uma pipeta de transferência de plástico. Além disso preparar um copo para anestesiar os peixes e uma colher de plástico para transferir o peixe. Durante a cirurgia, os peixes são colocados em uma esponja úmida com o seu lado ventral para cima (Figura 1B). Para segurar o animal num procedimento estável, umaranhura apropriada deve ser cortado manualmente na esponja. Preparar um tanque com água do sistema para transferir o peixe após a cirurgia. Defina um temporizador duplo pela primeira vez com uma contagem regressiva de 10 segundos e, então, automaticamente contagem regressiva de 24 segundos. 2. O procedimento Cryoinjury Arrefecer a cryoprobe por imersão da ponta em 3-5 cm de azoto líquido durante pelo menos 3 min. Anestesiar um peixe-zebra adulto por imergindo-o em tricaina 0,02% até o peixe se transforma em suas costas e suas brânquias quase parar de se mover (aproximadamente 90 segundos). Transferir o peixe com uma colher de plástico a uma esponja húmido que foi cortado para segurar um peixe de cabeça para baixo (Figura 1B). Segure firme peixe com uma pinça, utilizando mão não dominante. Localizar visualmente a margem posterior medial do coração e usar a tesoura iridectomia retas para perfurar a pele. (Figura 1C). Faça uma incisão (aprox. mm 2) pequeno acima do coração pelo cuObtenção de hetero anteriormente através da pele, dos músculos (Figura 1D). Não corte através do aparelho branquial óssea, como isso vai matar o animal. Suavemente rasgar a camada prateada epitelial da hipoderme (Figura 1E), com a ponta da tesoura para ter um acesso directo ao ventrículo de bater. Não inserir as tesouras mais profunda na cavidade do corpo, como esta punção vontade do coração. O batimento cardíaco deve ser bem visível, e sem sangramento extensa deve ocorrer durante a toracotomia (Figura 1F). Inicie o temporizador programado que foi definido para 10 segundos, seguido por 24 segundos. Durante 10 segundos tirar o cryoprobe a partir do azoto líquido. Certifique-se que não há mais nitrogênio no cryoprobe agitando-o suavemente. Espalhe a incisão lateral usando uma pinça para abrir o tórax (Figura 1F). Uma vez que o temporizador anéis 10 segundos, tocar imediatamente, mas suavemente o ventrículo com a ponta do pre-arrefecida cryoprobe (Figura 1G). Uma vez que os anéis do temporizador 24 segundos, despeje 2-3 mL de água do sistema usando uma pipeta de plástico para o baú para liberar a cryoprobe de tecido, e transferir os peixes no tanque com água do sistema. O peixe deve reiniciar a respiração depois de alguns segundos, e então ele deve retomar a natação. Se ele não respirar após cerca de 45 segundos, estimular o animal por injecção de água nas guelras com uma pipeta de plástico, até que começa a respirar por si só. Na nossa experiência, 95% dos peixes sobreviver a cirurgia, e todas as mortes ocorrer no dia da cirurgia. Não será necessário para suturar incisões. 3. Colecção coração e Fixação Prepare 1 mL de formalina a 2% em um tubo de microcentrífuga de fixação do coração, duas pinças, micro-dissecando tesoura ea esponja húmida ranhurada. No dia seleccionados após cryoinjury, euthanize o peixe em tricaina 0,1% durante 5 minutos. Colocar opeixe lado ventral para cima em uma esponja, úmido entalhada. Faça uma incisão (cerca de 4 mm) grande acima do coração através da cartilagem branquial com a tesoura micro dissecação. Abra amplamente incisão a com uma pinça (Figura 1H). Beliscar fora do bulbo arterial, uma estrutura branca anterior para o ventrículo (Figura 1 HI), e remover o coração da cavidade puxando-o. Um todo o coração dissecado é mostrado na Figura 1J e Figura 2a. Coloque até 3 corações para um tubo de microcentrífuga com 1 ml de formalina a 2%. Suavemente ligar o tubo várias vezes e mantê-lo durante a noite a 4 ° C. 4. Coração de montagem Lavar os corações em PBS durante 5 minutos. Transfira os corações em 10 mL de sacarose a 30% que devem ser pré-arrefecido a 4 ° C, e misturar suavemente. A amostra deve inicialmente flutuar na superfície da solução de sacarose. Continue a incubação durante 1 hora e 20 minutos a 4 ° C. DepoisNeste momento, os corações irá afundar para o fundo do tubo. Prepara-se uma caixa com gelo seco. Tomar um molde de encaixe, e verta uma camada de 5 mm de outubro meio de montagem na parte inferior do molde. Com uma pinça colocar o coração no T OC meio de montagem no molde. Sob o microscópio estereoscópico, ajustar a orientação do espécime para atingir o ápice ventricular na parte inferior do molde, eo bulbus arterial em direcção ao topo. Colocar os moldes com a amostra em gelo seco. Quando o meio de montagem começa a congelar, encher o resto do molde com o meio de outubro e deixá-lo congelar completamente. Manter o molde durante pelo menos 1 h à temperatura de -80 ° C antes de seccionamento. A amostra congelada pode ser armazenado durante muitos meses à temperatura de -80 ° C. 5. Corações seccionadoras Configurar um criostato com um tamanho de corte de 16 uM, uma temperatura da câmara de -24 ° C ea temperatura da amostra a -22 ° C. Colocar o bloco congelado com oespécime no criostato e fixar a sua orientação para iniciar o corte paralelo para a parte inferior do bloco. Preparar seis Superfrost-plus lâminas por um bloco e numerar-os de 1 a 6. Inicie o corte até o tecido é atingido, e cortar o bloco em torno da amostra com uma lâmina. Para obter 6 repetições de um coração, ocupam a primeira seção slide 1, a segunda seção no slide 2, o terceiro em slide 3, etc Uma vez que você colocou a sexta seção em slide 6, reinicie com slide 1 e continuam até o órgão inteiro é cortado. Coletar duas fileiras de cerca de 8 seções no slide (Figura 3). Deixe as lâminas seca durante 1 hora à temperatura ambiente. Armazená-los durante até 1 ano em caixas hermeticamente fechados a -20 ° C. 6. Os resultados representativos Lesão cardíaca representativas seguindo este protocolo é mostrado na dissecados todo o coração a 4 DPCI (cryoinjury pós dia; Figura 2D-F). Para visualize o tecido do miocárdio in vivo, foram utilizados os peixes transgénicos expressando EGFP e DsRed2 nuclear sob o controlo de cardíaco promotor específico CMLC-2 11,12. A ausência de EGFP e DsRed2 sinais fluorescentes demarcada uma zona de enfarte em forma de disco ao longo da parede ventricular apical-lateral. Para realizar análises celulares e moleculares do tecido, os corações foram fixados e cortados com um criostato. Uma lâmina representativa com uma série consecutiva de secções transversais do coração é mostrado na Figura 3. As secções podem ser analisados ​​com vários métodos (Figura 4). Para determinar a extensão da regeneração cardíaca versus cicatrizes, foi realizada uma análise histológica utilizar o ácido Fucsina Orange-G (AFOG) de coloração, que diferencialmente rotula tecidos cardíacos e fibrótico 9. As análises de expressão de genes foram alcançados de acordo com o processo de hibridação in situ <sup> 13. Para detectar a distribuição de proteínas marcadoras, aplicou-se imunofluorescência com anticorpos específicos 9. Uma combinação de procedimentos de coloração diversas conduz à identificação dos mecanismos moleculares e celulares envolvidas na cryoinjury cardíaca regeneração seguinte. Figura 1. Induzir cryoinjury do ventrículo no peixe-zebra adulto. (A) Uma fotografia do criossonda. (B) Um peixe-zebra adulto é colocado na fenda da esponja com o seu lado ventral para cima. (CF) incisão no peito para acessar o coração. (C) Um pequeno corte através da pele e musculatura é feita entre as duas aletas peitorais (linha vermelha). (D) A tesoura são inseridos na incisão para cortar a pele após a seta vermelha. (E) por debaixo da pele, a camada fina de hipoderme prateado (rodeado por linha tracejada azul) é suavemente aberta para acesso ao coração. (F) A incisão é espalhado com ofórceps e do ventrículo batendo (seta verde) é acessível para cryoinjury. (G) A cryoprobe frio é suavemente inserido no peito para tocar o coração. (HJ) coleta de coração. (H) A incisão profunda e longa é feita através dos arcos branquiais do tórax para acessar a cavidade pericárdica. Duas estruturas cardíacas são visíveis: bulbo arterial (seta branca) e do ventrículo esquerdo (seta verde). (I) O bulbo arterial é segurar com uma pinça e retirado da cavidade do corpo. (J) O coração inteiro é excisada a partir de do corpo. Figura 2. Controle Representante e corações dissecados cryoinjured de zebrafish transgênicos expressando EGFP adulto e DsRed2 nuclear em cardiomiócitos. (AC) ileso coração. (A) A iluminação de campo escuro mostra o ventrículo (V), bulbus arterial (Ba, branco) e as válvulas (Va), em que o átrio foi ligado para o ventrículo. (B e C) imagens fluorescentes de t ele EGFP exibição intacta ventrículo e DsRed2 expressão em cardiomiócitos. (DF) Coração a 4 dias pós cryoinjury (4 DPCI) (D) A iluminação de campo escuro revela um enfarte em forma de disco (linha a tracejado amarelo). (EF) Cardiomyocyte marcadores EGFP e DsRed2 não são detectados na área do enfarte, indicando o miocárdio danificado (rodeado por linha tracejada). Figura 3. Seccionamento do coração. (A) de todo o coração com o desenho de secções transversais de partida a partir do fundo do coração (1 e 2, em vermelho) para o topo do coração (3 e 4 em verde). (B) Fotografia de um slide com a série de sucessivos cortes transversais corados com AFOG (fucsina ácida Orange-G). As primeiras seções (1 e 2, quadrados vermelhos) contêm o ápice ventricular, e as últimas seções do coração (3 e 4, quadrados verdes) compreendem bulbo arterial. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/> A Figura 4. Exemplos de análise realizada em secções de coração a 7 dias pós cryoinjury. (A) AFOG etiquetas (fucsina ácida Orange-G) de coloração saudáveis ​​musculares células em laranja, o tecido da cicatriz contendo colagénio em azul e fibrina em vermelho. (B) A hibridação in situ da cadeia pesada da miosina ventricular (vmhc) ARNm visualiza o miocárdio intacta (coloração com azul). O tecido lesionado é desprovida da transcrição do gene cardíaco (linha tracejada vermelho). (C) imunoenzimático de tropomiosina (verde) rotula cardiomiócitos intactas e não tecido danificado (cercado com a linha pontilhada). DAPI (azul) manchas os núcleos de todas as células. (D) cardiomiócitos geneticamente marcadas expressa DsRed2 (vermelho) em seus núcleos. DAPI (azul) rotula todos os núcleos. A zona do enfarte não contém DsRed2 células positivas (linha a tracejado branco).

Discussion

Cryoinjury é definido como o dano de tecido controlada pela aplicação precisa de ¹⁴ frio extremo. Choque térmico directo destrói as células por destruição de proteínas e por intracelular formação de cristais de gelo de fluido que rompe a membrana plasmática. Por conseguinte, as células lesadas morrer nos processos de apoptose e necrose ^14. Ambos estes mecanismos de morte celular têm sido mostrados para contribuir para a perda de tecido após enfarte do miocárdio ^15. Assim, cryoinjury representa um modelo adequado de induzir um enfarte cardíaco. Vários estudos têm relatado este método bem provado em vários mamíferos, incluindo camundongos, ratos, coelhos e suínos ^6,7. A adaptação do protocolo cryoinjury em peixes-zebra permite uma discussão mais comparativa sobre a resposta do enfarte entre diferentes espécies.

Dois outros grupos independentemente desenvolveu o procedimento cryoinjury para o coração do peixe-zebra adulto. As principais diferenças são o surmétodos Gery, o tipo de ferramentas e aplicado tempo de congelamento. No estudo de González et al-Rosa., O pericárdio foi aberto rasgando o tecido em vez de cortar. Usaram 0,3 filamento de cobre milímetros ligada a um tubo de poliamida pré-arrefecidos em azoto líquido para congelar o coração durante alguns segundos até descongelamento pode ser observado ^10. No estudo de Schnabel et ai., Um pedaço de gelo seco cónico de 20 mm de comprimento com uma extremidade pontiaguda de 2 mm no seu diâmetro foi usado para tocar o coração durante 10 segundos ^8. Os dois grupos obtiveram dano ventricular através da morte do miocárdio. A vantagem do nosso método é uma deposição mais reprodutível de colagénio-rico cicatriz, o que melhor imita as respostas precoces infarto de cura observados em sistemas de mamíferos.

O passo crítico durante o procedimento de cryoinjury em peixes-zebra está a fazer uma incisão através da pele e do saco pericárdico sem puncionar o coração subjacente. Uma corretamente performed cirurgia provoca pouco sangramento. Sangramento profuso indica uma punção não-intencional do ventrículo com a tesoura. Em tais casos, os animais devem ser retraído a partir da experiência. A fim de evitar a perfuração do coração, do ponto de tesoura deve ser dirigida a um ângulo raso para a pele.

Outro aspecto importante para a criação de uma lesão reprodutível é o posicionamento exacto da cryoprobe frio no ventrículo para a duração óptima preciso. Demasiado curto tempo de congelamento vai resultar em inflamação com a morte de células pouco. O congelamento prolongado, por outro lado, pode causar danos extensos do coração, o que pode levar à mortalidade melhorada dos animais. Nós determinamos que o tempo óptimo para segurar o ventrículo nas gamas estado congelado entre 23-26 segundos para um 2 centímetros peixe-zebra longo do adulto, que pode ser diferente dependente do tamanho dos animais.

Porque o nosso protocolo é muito simples e rápida, não há nenhum limite experimentalções em sujeitando número suficiente de animais para obter adequados repetições biológicas. O tratamento criocirúrgico é muito bem tolerada pelos animais. Colecção dos corações em momentos diferentes após cryoinjury permite a caracterização detalhada das fases subseqüentes durante o processo regenerativo. A análise experimental dos corações cryoinjured pode incluir 1) visualização da transcrição de genes por hibridização in situ, 2) detecção de distribuição de proteína por coloração imunofluorescente, 3) imagiologia histológica de estruturas diferentes. Compreender os processos de cura chave após infarto do miocárdio em zebrafish terá impacto no campo da biologia regenerativa. Além disso, pode ser benéfico para a concepção de novas abordagens terapêuticas em medicina regenerativa.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co., Inc.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8	Polyscience, Inc.	18985