Zebrafisk repræsenterer en værdifuld model til at studere de mekanismer hjerte regenerering i hvirveldyr. Her præsenterer vi en protokol for induktion af et hjerte infarkt hos voksne zebrafisk hjælp kryobeskadigelse. Denne metode resulterer i massiv celledød i 20% af den ventrikulære væg, der ligner den, der observeres i mammale infarkter.
Pattedyr hjertet er i stand til signifikant regenerering efter en akut skade, såsom myokardieinfarkt 1. Derimod bevarer urodele padder og benfisk en bemærkelsesværdig evne til hjerte regeneration med ringe eller ingen ardannelse hele livet 2,3. Det vides ikke, hvorfor kun nogle ikke-pattedyr hvirveldyr kan genskabe en komplet orgel fra rest væv 4,5. For at forstå de molekylære og cellulære forskelle mellem regenerative reaktioner i forskellige arter, er vi nødt til at anvende lignende metoder til at fremkalde akutte skader.
I pattedyr, er det hyppigst anvendte model til at studere hjerte reparation er akut iskæmi efter ligering af koronararterie eller vævsødelæggelse efter kryobeskadigelse 6,7. Den kardielle regenerering i salamandre og zebrafisk er blevet overvejende undersøgt efter en delvis resektion af den ventrikulære Apex 2,3. Nylig har adskillige grupper har established den kryobeskadigelse teknik voksne zebrafisk 8-10. Denne fremgangsmåde har et stort potentiale, da det tillader en sammenlignende diskussion af resultaterne opnået fra pattedyr og ikke-pattedyr.
Her præsenterer vi en metode til at fremkalde en reproducerbar skiveformet infarkt af zebrafisk ventrikel ved kryobeskadigelse. Denne skade model er baseret på hurtig frysning-optøning væv, hvilket resulterer i massiv celledød på omkring 20% af kardiomyocytter i den ventrikulære væg. Først blev et lille indsnit foretages gennem brystet med iridectomy saks adgang til hjertet. Ventrikelvæggen blev direkte frosset ved at ansøge om 23-25 sekunder af rustfrit stål cryoprobe forkølet i flydende nitrogen. At standse frysning af hjertet, fisk vand ved stuetemperatur blev dryppet på spidsen af cryoproben. Fremgangsmåden tolereres godt af dyrene, med en overlevelsesgrad på 95%.
For at karakterisere regenerative proces, hjerter varindsamlet og fast på forskellige dage efter kryobeskadigelse. Efterfølgende blev prøven indlejret for cryosectioning. Objektglassene med sektioner blev behandlet til histologisk analyse, in situ hybridisering og immunofluorescens. Dette tilsagn øger vores forståelse af de faktorer, der er nødvendige for regenerativ plasticitet i zebrafisk, og give ny indsigt i maskinerne af hjertets regenerering. En begrebsmæssig og molekylær forståelse af hjertet regenerering i zebrafisk vil påvirke både udviklings-biologi og regenerativ medicin.
Kryobeskadigelse er defineret som den styrede beskadigelse af væv ved den præcise anvendelse af ekstrem kulde 14. Direkte termisk chok ødelægger celler ved protein ødelæggelse og intracellulære væske iskrystaldannelse at brydes plasmamembranen. Følgelig de beskadigede celler dør i fremgangsmåderne ifølge apoptose og nekrose 14. Begge disse celledød mekanismer er blevet vist at bidrage til tab af væv efter myokardieinfarkt 15. Således kryobeskadigelse betegner en egnet model til at inducere et hjerte infarkt. Adskillige studier rapporterede dette godt bevist metode i forskellige pattedyr, herunder mus, rotter, kaniner og grise 6,7. Den tilpasning af kryobeskadigelse protokollen i zebrafisk muliggør en mere komparativ diskussion om infarkt respons mellem forskellige arter.
To andre grupper udviklede uafhængigt kryobeskadigelse proceduren for voksne zebrafisk hjertet. De store forskelle er surGerys metoder, typen af værktøjer og anvendes frysning tid. I undersøgelsen af Gonzalez-Rosa et al. Blev pericardium åbnet ved oprivning vævet i stedet for skæring. De brugte 0,3 mm kobber endeløse knyttet til en polyamid rør på forhånd afkølet i flydende nitrogen til at fryse hjertet i et par sekunder, indtil optøning kunne observeres 10. I undersøgelsen af Schnabel et al. En konisk stykke tøris 20 mm længde med en spids på 2 mm i diameter blev anvendt til at røre hjertet i 10 sekunder 8. De to grupper opnåede ventrikulær skader gennem døden af myokardiet. Fordel af vores fremgangsmåde er en mere reproducerbar aflejring af kollagen-rige ar, som bedre efterligner de tidlige infarkt helbredende responser observeret i mammale systemer.
Det kritiske trin i kryobeskadigelse fremgangsmåden i zebrafisk er et snit gennem huden og pericardiale sæk uden at punktere den underliggende hjertet. En korrekt performed kirurgi forårsager mindre blødning. Voldsom blødning angiver en utilsigtet punktering af ventriklen med saks. I sådanne tilfælde bør dyrene trækkes ud af eksperimentet. For at undgå at punktere hjerte, bør det punkt saks være rettet mod en flad vinkel i forhold til huden.
Et andet vigtigt aspekt for at skabe en reproducerbar skade, er den nøjagtige placering af den kolde cryoproben i ventriklen for den optimale præcise varighed. For kort frysning tid vil resultere i inflammation med lille celledød. Langvarig nedfrysning på den anden side forårsager kan omfattende beskadigelse af hjertet, hvilket kan føre til forøget dødelighed af dyrene. Vi bestemt, at den optimale tid til at holde ventrikel i frossen tilstand ligger i området mellem 23-26 sekunder for en 2 cm lang voksen zebrafisk, og det kan være forskelligt dosisafhængigt på størrelsen af dyrene.
Fordi vores protokol er meget enkel og hurtig, der er ingen eksperimentelle begrænsningtioner i underkaste tilstrækkeligt antal dyr for at opnå tilstrækkelige biologiske replikationer. Den kryokirurgiske behandling udmærket tåles af dyrene. Indsamling af hjerter på forskellige tidspunkter efter kryobeskadigelse giver detaljeret karakterisering af de efterfølgende faser i løbet af regenerative proces. Den eksperimentelle gennemgang af de cryoinjured hjerter kan omfatte 1) visualisering af gentranskription ved in situ hybridisering, 2) påvisning af protein fordeling ved immunofluorescent farvning, 3) histologisk billeddannelse af forskellige strukturer. Forståelse af de vigtigste helbredende processer efter myokardieinfarkt i zebrafisk vil påvirke området for regenerativ biologi. Endvidere kan det være gavnligt for at designe hidtil ukendte terapeutiske strategier til regenerativ medicin.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker V. Zimmermann for fremragende teknisk bistand og til fisk pleje. Dette arbejde blev støttet af den schweiziske National Science Foundation, tilskud nummer: 310000_120611.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |