Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten
Summary
Ein<em> In-vitro-</em> Verfahren zu imitieren<em> In-vivo-</em> Epithelialen Differenzierung beschrieben. Viele Viren zielen Epithelzellen als Teil ihrer viralen Lebenszyklus, und diese Methode liefert ein Mittel zur Prüfung Virus: Wirt-Interaktionen, die ähnelt mehr dem, was kommt<em> In-vivo-</em>. Diese Technik kann mit primären Keratinozyten, etablierte Zelllinien, sowie normaler oder kranker Biopsie Gewebe verwendet werden.
Abstract
Die Entwicklung von organotypischen Kulturen epithelialen Floß hat die Forscher mit einer effizienten In-vitro-System zur Verfügung gestellt, der naturgetreu rekapituliert epithelialen Differenzierung. Es gibt viele Einsatzmöglichkeiten für dieses System. So hat die Fähigkeit zur dreidimensionalen organotypischen Floß Kulturen von Keratinozyten wachsen war ein wichtiger Meilenstein in der Erforschung des humanen Papillomavirus (HPV) 1. Der Lebenszyklus des HPV ist eng mit der Differenzierung von Plattenepithel 2 verknüpft. Organotypische epithelialen Floß Kulturen wie hier gezeigt reproduzieren das gesamte Papillomavirus Lebenszyklus, einschließlich Virus-Produktion 3,4,5. Darüber hinaus weisen diese Floß Kulturen Dysplasien der vergleichbar, die sich auf In-vivo-Infektion mit HPV. Daher kann dieses System auch verwendet werden, um Epithelzellen Krebsarten, sowie die Wirkung von Medikamenten auf Epithelzellendifferenzierung im allgemeinen zu untersuchen. Zitat von Asselineau und Prunieras entwickelt <sbis> 6 und modifiziert durch Kopan et al. 7, der organotypischen Kultur epithelialen Floß-System in einer allgemeinen, relativ leicht Kultur Modell, das das Wachstum von Zellen auf Kollagen umfasst reifen Stecker gehalten bei einem Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (1A). Im Laufe von 10-14 Tagen, die Zellen Schichtung und Differenzierung, die Bildung eines vollständigen Dicke Epithel, das differenzierungsspezifische Cytokeratine produziert. Geerntet Flöße können histologisch untersucht werden, sowie von Standard-molekularen und biochemischen Techniken. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung von Raft-Kulturen aus primären humanen Keratinozyten. Die gleiche Technik kann mit bestimmten epithelialen Zelllinien verwendet werden, und kann leicht für die Verwendung mit Epithelgewebe von normalen oder kranken Biopsien 8 angepasst werden. Viele Viren zielen entweder auf die Haut oder Schleimhaut Epithel als Teil ihrer replikativen Lebenszyklus. In den vergangenen Jahren mit der Machbarkeit von organotypischen Floß Kultnahmen als Methode zur Untersuchung Virus-Wirt-Zell-Wechselwirkungen seit mehreren Herpesviren, sowie Adenoviren, Parvoviren, und Pockenviren 9 gezeigt. Organotypische Floß Kulturen können somit an viralen Pathogenese zu untersuchen, und sind die einzigen Mittel, um neuartige antivirale Mittel für jene Viren, die nicht kultivierbaren in permanenten Zelllinien zu testen.
Protocol
Discussion
Wir beschreiben hier eine Methode, die verwendet werden, um epitheliale Differenzierung im allgemeinen studieren kann, kann aber auch einfach an viralen Pathogenese, sowie die Wirksamkeit von potenziellen Therapeutika zu studieren. Viele Viren Ziel Epithelzellen entweder als primäre Ort der Infektion, wie im Fall von HPV, oder an irgendeinem Punkt in dem viralen Lebenszyklus, wie bei Herpesviren. Obwohl wachsende organotypischen Kulturen Floß ist zeitaufwendig, die Fähigkeit, treu in vivo epithelialen Differ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham UK) für die freundliche Gabe des Antikörpers E1E4 danken. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Cancer Institute (4R00CA137160-03) unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 |
| NaHC03 | Sigma | S5761 |
| Hepes | Calbiochem | 391338 |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S |
| E medium11 | ||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. . Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. . Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections–a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
