Generering av Organotypic Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

Summary

En<em> In vitro</em> Metoden for å etterligne<em> In vivo</em> Epitelial differensiering er beskrevet. Mange virus målrette epitelceller som en del av deres viral livssyklus, og denne metoden gir et middel for å undersøke viruset: vert interaksjoner som mer ligner det som skjer<em> In vivo</em>. Denne teknikken kan brukes med primære keratinocytter, etablerte cellelinjer, samt normal eller sykelig vevsprøver.

Abstract

Utviklingen av organotypic epiteliale flåte kulturer har gitt forskere med en effektiv in vitro system som trofast sammenfatter epitelial differensiering. Det er mange bruksområder for dette systemet. For eksempel har evnen til å vokse tredimensjonale organotypic flåte kulturer av keratinocytter vært en viktig milepæl i studiet av humant papillomavirus (HPV) ^1. Livssyklusen til HPV er tett knyttet til differensiering av plateepiteldysplasi ^to. Organotypic epiteliale flåte kulturer som demonstreres her gjengi hele papillomavirus livssyklus, inkludert virus produksjon ^3,4,5. I tillegg er disse flåte kulturene stille dysplastiske lesjoner som ligner de som ble observert på in vivo infeksjon med HPV. Derfor dette systemet kan også brukes til å studere epithelial celle kreft, samt effekten av narkotika på epithelial celledifferensiering generelt. Opprinnelig utviklet av Asselineau og Prunieras <sopp> 6 og modifisert av Kopan et al. ^7, har organotypic epiteliale flåten kultur system modnet til en generell, relativt enkel kultur modell, som innebærer vekst av celler på kollagen plugges opprettholdes på en luft-væske-grensesnittet (Figur 1a). I løpet av 10-14 dager, cellene stratify og differensiere, danner en full tykkelse epitel som produserer differensiering-spesifikke cytokeratins. Høstes flåter kan bli undersøkt histologisk, samt av standard biokjemiske og molekylærbiologiske teknikker. I denne artikkelen beskriver vi en metode for generering av flåte kulturer fra primære humane keratinocytter. Den samme teknikken kan brukes med etablerte epiteliale cellelinjer, og kan lett tilpasses for bruk med epitelvev fra normale eller syke biopsier ^8. Mange virus målet enten kutan eller mucosal epitel som en del av deres replicative livssyklus. I løpet av de siste årene, muligheten for å bruke organotypic flåte kulttiltak som en metode for å studere virus-vert celle interaksjoner har blitt vist i flere herpesviruses, samt adenoviruses og parvoviruses og poxviruses ^9. Organotypic flåte kulturer kan slik tilpasses undersøke viral patogenese, og er den eneste måten å teste nye antivirale midler for de virus som ikke er dyrkbar i permanente cellelinjer.

Protocol

1. Forberedelse til Organotypic Raft kulturer Metallet flåte rister mye første behandles med kromsyre svovelsyre for å fjerne eventuelle rester som kan forstyrre differensiering prosessen. Fordype metall tavler i et glass begerglass som inneholder svovelsyre i en time, deretter kontinuerlig skylles over natten med vann fra springen. Etter natten skylling, bør flåte grid skylles i 3-5 timer i dobbelt destillert vann. Å gi støtte til flåter, bøye tre sider av flåten ca 0,5 cm på lik avstand…

Discussion

Vi beskriver her en metode som kan brukes til å studere epitelial differensiering generelt, men kan også lett tilpasses for å studere viral patogenese, samt effekten av potensielle legemiddelselskap. Mange virus målrette epitelceller enten som det primære stedet for infeksjon, som i tilfelle av HPV, eller på et tidspunkt i viral livssyklus, som med herpesviruses. Selv om voksende organotypic flåte kulturer er tidkrevende, muligheten til å trofast rekapitulere in vivo epitelial differensiering gir en sv?…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010