Generering av Organotypiska Raft kulturer från Primary humana keratinocyter

Summary

En<em> In vitro</em> Metod för att efterlikna<em> In vivo</em> Epitelial differentiering beskrivs. Många virus rikta epitelceller som en del av virusets livscykel, och denna metod ger en möjlighet att undersöka virus: värd interaktioner som mer liknar den som sker<em> In vivo</em>. Denna teknik kan användas med primära keratinocyter, etablerade cellinjer, liksom normala eller sjuka biopsivävnad.

Abstract

Utvecklingen av organotypiska epiteliala flotte kulturer har gett forskarna med ett effektivt in vitro-system som troget rekapitulerar epitelial differentiering. Det finns många användningar för detta system. Till exempel har förmågan att växa tredimensionella organotypiska flotte kulturer av keratinocyter varit en viktig milstolpe i studiet av humant papillomvirus (HPV) ^1. Livscykeln för HPV är tätt knuten till differentieringen av skivepitel ^2. Organotypiska epiteliala flotte kulturer som visas här återge hela cykeln papillomvirus liv, inklusive virusproduktion ^3,4,5. Dessutom är dessa flotte kulturer uppvisar dysplastiska lesioner liknar de som observeras vid in vivo-infektion med HPV. Följaktligen detta system kan också användas för att studera epitelcellsystem cancrar, såväl som effekten av läkemedel på epitelial celldifferentiering i allmänhet. Ursprungligen utvecklad av Asselineau och Prunieras <sin> 6 och modifieras av Kopan et al. ^7, har den organotypiska epitelial flotten odlingssystem mognat till en generellt relativt lätt kultur modell, som involverar odling av celler på kollagen pluggar hölls vid en luft-vätske-gränssnittet (figur 1A). Under loppet av 10-14 dagar, cellerna skiktas och differentiera och bilda en full tjocklek epitel som producerar differentiering-specifika cytokeratiner. Skördade flottar kan undersökas histologiskt, såväl som genom standardmetoder molekylära och biokemiska tekniker. I den här artikeln beskriver vi en metod för generering av flotte kulturer från primära humana keratinocyter. Samma teknik kan användas med etablerade epitelcellinjer, och kan enkelt anpassas för användning med epitelial vävnad från normala eller sjuka biopsier ^8. Många virus mål antingen hud-eller slemhinneepitelet som en del av replikativa livscykel. Under de senaste åren, möjligheten att använda organotypisk flotte sektgärder som en metod för att studera virusvärdsystem cellinteraktioner har visats för flera herpesvirus samt adenovirus, parvovirus, poxvirus och ^9. Organotypiska flotte kulturer kan således anpassas för att undersöka viral patogenes, och är det enda sättet att testa nya antivirala medel för de virus som inte är odlingsbar i permanenta cellinjer.

Protocol

1. Förberedelse för Organotypiska Raft kulturer Metall flotte gallren mycket först behandlas med kromsyra svavelsyra för att avlägsna eventuella rester som skulle kunna störa differentiering processen. Doppa metallgaller i en glasbägare innehållande svavelsyra i en timme, därefter kontinuerligt sköljdes över natten med kranvatten. Efter över natt sköljning bör flotte galler sköljas i 3-5 timmar i dubbeldestillerat vatten. Att tillhandahålla stöd för de flottar, böj tre sidor av fl…

Discussion

Vi beskriver här en metod som kan användas för att studera epiteldifferentiering i allmänhet, men kan också lätt anpassas för att studera viral patogenes, såväl som effekten av potentiella läkemedel. Många virus rikta epitelceller antingen som den primära platsen för infektion, som i fallet med HPV, eller vid någon punkt i virusets livscykel, som med herpesvirus. Även om allt organotypiska flotte kulturer är tidskrävande, förmågan att troget rekapitulera in vivo epitelial differentiering ger …

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog number
Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
DMEM without NaHC03	Invitrogen	12100-061
NaHC03	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Stainless Steel metal grids	Williams and Mettle Co.	CR-03063-040-100-S
E medium11
Epidermal Growth Factor	BD Biosciences	354010