Summary

דיסקציה והתרבות של עכבר דופאמין ו Explants Striatal ב תלת ממדי מבחני מטריקס קולגן

Published: March 23, 2012
doi:

Summary

Explants ממערכת המוח התיכון דופאמין הסטריאטום משמשים assay קולגן מטריקס עבור<em> במבחנה</em> ניתוח של פיתוח מסלול mesostriatal ו striatonigral. ב assay זו תוצאה הדרכה axonal והוא יכול לטפל לכמת. זה גם יכול להיות שונה להערכת באזורים אחרים או סימנים מולקולריים.

Abstract

הדופמין במוח התיכון (mdDA) נוירונים הפרויקט באמצעות צרור המוח הקדמי המדיאלי כלפי כמה אזורים telencephalon, כולל 1 הסטריאטום. הדדי, הנוירונים קוצניים בינוני בסטריאטום שיוצרים מסלול (ישיר) striatonigral innervate nigra substantia 2. פיתוח של שטחים אלה האקסון תלויה בפעולות קומבינטורית של שפע של צמיחה האקסון ואת רמזים הדרכה כולל מולקולות שפורסמו על ידי neurites או (ביניים) אזורים היעד 3,4. גורמים אלה מסיסים ניתן ללמוד במבחנה על ידי mdDA culturing ו / או explants striatal במטריצה ​​קולגן אשר מספק מצע תלת מימדי על אקסונים מחקה את הסביבה תאיים. בנוסף, מטריקס מאפשרת קולגן ליצירת שיפועים יציבה יחסית של חלבונים שפורסמו על ידי explants או תאים אחרים המוצבים בסביבה (למשל, לראות את הפניות 5 ו -6). כאן אנו מתארים את שיטות פורification של קולגן עכברוש הזנב, microdissection explants של דופאמין ו striatal, התרבות שלהם ג'ל קולגן וניתוח immunohistochemical וכמותית שלאחר מכן. ראשית, במוחם של עוברי עכברים E14.5 הם מבודד דופאמין ו explants striatal הם microdissected. Explants אלה מכן (CO) בתרבית ג'ל קולגן על coverslips במשך 48 עד 72 שעות במבחנה. כתוצאה מכך, תחזיות axonal הם דמיינו באמצעות סמנים עצביים (tyrosine hydroxylase למשל, DARPP32 או טובולין βIII) וצמיחה האקסון ותגובות האקסון אטרקטיביים או דוחה הם הניתנים לכימות. זו הכנה עצבי הוא כלי שימושי עבור במבחנה של המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון mesostriatal ו striatonigral והדרכה במהלך הפיתוח. שימוש assay זה, אפשר גם להעריך אחרים (ביניים) מטרות אקסונים דופאמין ו striatal או לבדוק אותות מולקולריים מסוימים.

Protocol

1. הכנת קולגן זנב עכברוש איסוף 6-10 זנבות עכברים בוגרים (ניתן לאחסן את זנבות ב -20 ° C עד השימוש). משרים את זנבות באתנול 95% בין לילה בטמפרטורת החדר (RT). דיס…

Discussion

Assay מטריקס קולגן המתואר כאן נעשה שימוש ושיפרה ידי מעבדות רבות בעשורים האחרונים לחקור מגוון רחב של מולקולות האקסון הדרכה ומערכות עצביות (למשל לראות הפניות 5-8). מחקרים אלה הראו כי assay זה הוא כלי רב עוצמה לחקר תופעות ורגולציה של מולקולות האקסון הדרכה המופרשים על ידי (ביני…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Assay מטריצת הקולגן פותחה לשפר על ידי עבודה של הרבה קבוצות מחקר שונות במהלך השנתיים עד שלוש השנים האחרונות. הגישות המתוארות כאן explants דופאמין ו striatal תועלת רבה ממחקרים אלה. בנוסף, החוקרים מודים Asheeta פראסאד על עזרתה בהקמת תרבויות explant striatal. לעבוד במעבדה מומן על ידי ארגון Human תוכנית המדע הגבול (פיתוח פרס קריירה), ארגון הולנד למחקר בריאות ופיתוח (ZonMW-VIDI ZonMW ו-TOP), האיחוד Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , גרנט 222999) (כדי RJP), לבין ארגון הולנד למחקר מדעי (TopTalent, כדי Eres).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Fetal Calf Serum BioWhittaker 14-801F  
Glutamine (200mM) PAA M11-004  
Hepes VWR International 441476L  
β-Mercaptoethanol Merck 444203  
Minimum Essential Media (MEM) Gibco 61100-087  
Neurobasal Gibco 21103-049  
B27 Gibco 17504-044  
Leibovitz’s L-15 Medium Gibco 11415-049  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063  
Prolong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930  
Dialysis tubing Spectrum Labs 132660  
Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase Pel-Freez P40101-0  
Rabbit anti-Darpp32 (H-62) Santa-Cruz Sc-11365  
Mouse anti-βIII tubulin Sigma T8660  
Alexa Fluor labeled secondary antibodies Invitrogen    

References

  1. van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
  2. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  3. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
  4. Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
  5. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
  6. Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
  7. Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
  8. Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
  9. Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
  10. De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
  11. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).

Play Video

Cite This Article
Schmidt, E. R., Morello, F., Pasterkamp, R. J. Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays. J. Vis. Exp. (61), e3691, doi:10.3791/3691 (2012).

View Video