Fare Dopaminerjik ve Üç Boyutlu Collagen Matrix Tahliller striatal Eksplantlarından diseksiyonu ve Kültür
Summary
Ortabeyin dopamin sistemi ve striatum gelen Eksplantlarından için bir kollajen matris deneyde kullanılır<em> In vitro</emMesostriatal ve striatonigral yolunun gelişimi> analizi. Bu deneyde aksonal üremeyi ve rehberlik manipüle ve ölçülebilir. Aynı zamanda diğer bölgeler veya moleküler ipuçlarını değerlendirmek için modifiye edilebilir.
Abstract
Striatum 1 dahil telencephalon çeşitli alanlarda, doğru medial ön beyin demeti ile orta beynin dopamin (mdDA) nöronlar projesi. Karşılıklı olarak, striatonigral (direkt) yol yol striatumda orta dikenli nöron substantia nigra 2 innerve. Bu akson yollarının geliştirilmesi akson büyüme ve neurites veya (orta) hedef bölgelerde 3,4 ile yayımlanan moleküllerini içeren rehberlik ipuçları bir bolluk kombinatoryal eylemleri bağlıdır. Bu faktörler çözünebilir ekstraselüler ortamı taklit aksonlardan için bir üç-boyutlu yüzey sağlar kollajen bir matris içinde kültürlenmesi mdDA ve / veya striatal eksplantları tarafından in vitro olarak ele alınabilir. Buna ek olarak, kolajen matris civarı (örn. referanslar 5 ve 6'ya bakınız) yerleştirilir, diğer aşılar veya hücreler tarafından yayımlanan proteinlerin nispeten kararlı gradyanlar oluşumu için olanak sağlar. Burada pur için yöntemler tarifkollajen jeller ve sonraki immünohistokimyasal ve kantitatif analiz, fare kuyruk kolajeni, dopaminerjik ve striatal eksplantlarının mikrodiseksiyon, kendi kültür ification. Birincisi, E14.5 fare embriyolarının beyin izole ve dopaminerjik ve striatal eksplant microdissected edilir. Bunlar daha sonra eksplantları (CO), in vitro 48-72 saat boyunca lamelleri üzerine kollajen jeller kültürlenmiştir. Daha sonra, aksonal projeksiyonlar nöronal belirleyicileri (örneğin tirozin hidroksilaz, DARPP32 veya βIII tubulin) ve akson büyüme ve çekici veya itici akson yanıtları sayılabilir ve kullanarak canlandırırlar. Bu nöronal hazırlık gelişimi sırasında mesostriatal ve striatonigral akson büyüme ve rehberlik hücresel ve moleküler mekanizmalar in vitro çalışmalar için yararlı bir araçtır. Bu tahlil kullanarak, dopaminerjik ve akson striatal için diğer (ara) hedefler değerlendirmek için ya da belirli bir moleküler kuyrukları test etmek de mümkündür.
Protocol
Discussion
Kollajen matriks testi burada açıklanan (örneğin referanslar 5-8 bakınız) akson rehberliği moleküller ve nöronal sistemler çeşitli araştırmak için geçmiş yıllarda pek çok farklı laboratuvarlar tarafından kullanılmış ve geliştirilmiştir. Bu çalışmalar bu testte etkileri ve farklı (orta) hedef dokular tarafından salgılanan akson rehberliği moleküllerin düzenlenmesi çalışmaları için güçlü bir araç olduğunu göstermiştir.
Bununla birlikte, kolajen mat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kollajen matriks testi son iki üç yılda pek çok farklı araştırma gruplarının çalışmaları ile geliştirilmiş ve iyileştirilmiştir. Dopaminerjik ve striatal eksplant için buraya açıklanan yaklaşımlar büyük ölçüde bu çalışmalar yarar. Ayrıca, yazarlar striatal eksplant kültürleri kurarken ona yardım için Asheeta Prasad teşekkür etmek istiyorum. Laboratuvarda çalışmalar İnsan sınır Bilim Programı Örgütü (Kariyer Geliştirme Ödülü) tarafından finanse edildi, Sağlık Araştırma ve Geliştirme Hollanda Örgütü (ZonMW-VIDI ve ZonMW-TOP), Europanian Birliği (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 Grant 222.999) (RJP için) ve Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (TopTalent; ERES için).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
