Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität
Summary
Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.
Abstract
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zweiatomigen freien Radikalen, die extrem kurz in biologischen Systemen (weniger als 1 Sekunde im zirkulierenden Blut) 1 gelebt wird. NO kann als eines der wichtigsten Signalmoleküle in unserem Körper produziert werden, regulieren essentielle Funktionen einschließlich, aber nicht um Regulierung des Blutdrucks, Immunantwort und neuronalen Kommunikation begrenzt. Daher seine genaue Detektion und Quantifizierung in biologischen Matrices ist entscheidend für das Verständnis der Rolle von NO in Gesundheit und Krankheit. Mit einer solch kurzen physiologischen Halbwertszeit von NO, alternative Strategien für die Detektion von Umsetzungsprodukten von NO Biochemie entwickelt. Die Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächer liefert wertvolle Informationen im Hinblick auf in-vivo-NO-Produktion, Bioverfügbarkeit und Metabolismus. Einfach Probenahme aus einer einzigen Fach wie Blut oder Plasma kann nicht immer eine genaue Beurteilung der gesamten boDy keinen Status, vor allem in Geweben. Die Möglichkeit, Blut mit ausgewählten Geweben bei Versuchstieren zu vergleichen, wird dazu beitragen, die Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Medizin so weit wie diagnostischer und prognostischer Nutzen von NO-Biomarkern in Gesundheit und Krankheit. Daher ist die Extrapolation von Plasma oder Blut ohne Status zu spezifischen Geweben von Interesse nicht mehr ein gültiger Ansatz. Als Ergebnis weiterhin Methoden entwickelt und validiert werden, die es erlauben den Nachweis und die Quantifizierung von NO und NO-und Genussmittel / Metaboliten in mehreren Fächern von Versuchstieren in vivo. Die etablierten Paradigma der NO-Produktion durch die Biochemie von NO-Synthasen, um die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC), um eventuelle Oxidation zu Nitrit (NO 2 -) und Nitrat (NO 3 -) kann nur einen Teil der NO-Effekten in vivo. Die Wechselwirkung von NO und NO-abgeleiteten Metaboliten mit Thiolen, sekundären Aminen, und Metalle S-nitrosothi bildenole (RSNOs), N-Nitrosamine (RNNOs) und Nitrosyl-Häm jeweils für cGMP-unabhängige Effekte von NO und sind wahrscheinlich genauso wichtig wie physiologisch Aktivierung der sGC durch NO. Ein wahres Verständnis von NO in der Physiologie von in vivo Experimenten Probenahme mehrere Fächer gleichzeitig abgeleitet. Stickstoffmonoxid (NO)-Methodik ist eine komplexe und oft verwirrenden und Wissenschaft im Mittelpunkt vieler Debatten und Diskussionen über NO Biochemie. Die Aufklärung neuer Mechanismen und Signalwege unter Beteiligung keine Scharniere auf unserer Fähigkeit, spezifisch, selektiv und sensitiv detektieren und zu quantifizieren NO und NO alle relevanten Produkte und Metaboliten in komplexen biologischen Matrices. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle und hochempfindliche Analyse von Nitrit und Nitrat mittels HPLC sowie Nachweis von freiem NO in biologischen Proben mittels in vitro Ozon basierende Chemilumineszenz mit chemischen derivitazation auf molekularer Quelle von NO als auch ex vivo mit bestimmenOrganbad Myographie.
Protocol
Discussion
Die hier beschriebenen Methoden zur Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächern wird für Fingerabdruck des NO Biologie in Gesundheit und Krankheit, die mit funktionellen Messungen von NO durch das Endothel korreliert werden können. Diese Methoden erfordern einfache Probenvorbereitung mit Potenzial für die Anpassung für hohen Durchsatz. Die relative Menge dieser Moleküle kann helfen, die Produktion von NO und seinen Stoffwechsel in einer Reihe von experimentellen Modellen von Kran…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Hong Jiang, Ph.D. danke und Deepa Parathasarthy, MPH, BDS für die technische Unterstützung.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| N-ethylmaleimide | Thermo Scientific | 23030 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 |
| Potassium Ferricyanide | Fluka | 60299 |
| HPLC | Eicom Corp | ENO-20 |
| Autosampler | Alcott | |
| DMT Myograph | AD Instruments | |
| PowerLab | AD Instruments | |
| Chemiluminescent | EcoPhysics | CLD 88Y |
| Centrifuge | Eppendorf | 5415D |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 |
| R-(-) Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 |
References
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
