כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel
Summary
ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.
Abstract
ריקבון של דגנים על ידי הזרע, מדביק פטריות מהווה אחד האתגרים הכלכליים הגדולים ביותר ברחבי העולם ייצור דגני בוקר, שלא לדבר על סיכון רציני לבריאות האדם ובעלי חיים. בין ייצור דגנים, תירס הוא לטעון את היבול הנגוע ביותר, עקב פתוגן המושרה הפסדים שלמות תבואה זרע זיהום mycotoxin. שני mycotoxins הנפוצים ביותר ובעייתי עבור מגדלי תירס ומוצרי מזון מעבדים מזון הם אפלטוקסין ו fumonisin, המיוצר על ידי Aspergillus flavus ו verticillioides Fusarium, בהתאמה.
מחקרים שנעשו לאחרונה במפעל לפתוגן אינטראקציות מולקולריות הראו הבטחה בהבנת מנגנונים ספציפיים הקשורים תגובות צמחים לזיהום פטרייתי וזיהום mycotoxin 1,2,3,4,5,6. כי מעבדות רבות משתמשות מבחני ליבה ללמוד הצמח לפתוגן אינטראקציות, יש צורך בשיטה אחידה לכימות פרמטרים ביולוגיים שונים, כךתוצאות של מעבדות שונות ניתן לחצות, לפרש. עבור אמצעי חזקים לשעתקו עבור ניתוחים כמותיים על זרעים, פיתחנו ב-Lab מבחני ליבה ושיטות הבאים לכמת הצמיחה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin. ארבעה גרעיני תירס מעוקרים הם מחוסן ב צלוחיות זכוכית עם מתלה פטרייתי (10 6) מודגרת למשך פרק זמן מוגדר מראש. צלוחיות מדגם יבחרו מכן על ידי ניתוח ביומסה hemocytometer, ergosterol מבוסס על ספירה של נבגים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC), כימות אפלטוקסין באמצעות שיטה fluorometer AflaTest, וכימות fumonisin ידי HPLC.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות ברנדון הסאט וקרלוס אורטיז לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NSF IOB-0544428, IOS-0951272, ו IOS-0925561 ד"ר מיכאל Kolomiets, ועל ידי משרד החקלאות המכון הלאומי המזון והחקלאות (NIFA), גידול הצמח AFRI וחינוך גרנט # 2010-85117 ל -20,539 בני הזוג. סת מוריי, תומאס Isakeit, ו Kolomiets מייקל.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
