Количественная грибковой колонизации, спорогенеза, и производство микотоксинов Использование ядра Биопробы
Summary
Опустошение зерновых культур на семенные заражения грибками вызвало многочисленные исследовательские усилия, чтобы лучше понять растение-патоген взаимодействия. Для изучения семенного грибковых взаимодействия в лабораторных условиях, мы разработали надежный метод для количественного грибковых воспроизводства биомассы и микотоксинами с ядром биопробы.
Abstract
Гниение зерна на семенные заражения грибками представляет собой одну из величайших экономических проблем во всем мире производство зерновых, не говоря уже о серьезных рисков для здоровья человека и животных. Среди производство зерновых, кукурузы, вероятно, наиболее пострадавших сельскохозяйственных культур, в связи с возбудителем вызванного потерями в целостности зерна и загрязнения микотоксинами зерна. Две самые распространенные и проблемные микотоксинов на кукурузу производители пищевых продуктов и кормов процессоров афлатоксин и фумонизин, выпускаемых Aspergillus flavus и Fusarium verticillioides соответственно.
Недавние исследования в области молекулярной растительного взаимодействия возбудителя продемонстрировал перспективы в понимании конкретных механизмов, связанных с завода ответ на грибковую инфекцию и микотоксинами 1,2,3,4,5,6. Поскольку многие лаборатории используют ядро тесты для изучения растительного взаимодействия возбудителя, есть необходимость в стандартизированный метод для количественного различных биологических параметров, поэтомуРезультаты разных лабораториях могут быть перекрестно интерпретировать. Для надежной и воспроизводимой средствами для количественного анализа на семена, мы разработали в лаборатории анализов ядра и последующее методов количественного роста грибов, биомасса, и микотоксинами. Четыре ядра кукурузы стерилизовать засевают в стеклянных флаконах с грибковыми подвески (10 6) и выдерживают в течение определенного периода. Пример флаконов, то выбранный для перечисления конидий на гемоцитометра, эргостерола на основе биомассы анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), афлатоксин количественного использования AflaTest флуорометр метод и фумонизин количественного ВЭЖХ.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Брэндона Хассетт и Карлос Ортис за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами NSF IOB-0544428, 0951272, IOS, IOS-а 0925561 доктора Майкла Коломиец, а также Министерства сельского хозяйства США Национального института сельского хозяйства и продовольствия (НИФА), Afri селекции растений и образования грант № 2010-85117 -20539 до доктора. Сет Мюррей, Томас Isakeit, и Михаил Коломиец.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
