커널 Bioassays를 사용하여 곰팡이 콜로니, Sporogenesis 및 Mycotoxins 생산의 부량
Summary
종자 – 감염 곰팡이에 의한 시리얼 작물의 참화 더 나은 식물 병원체 상호 작용을 이해하기 위해 많은 연구 노력을하라는 메시지가있다. 실험실 환경에서 씨앗 – 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 곰팡이 복제, 바이오 매스, 그리고 커널 bioassays를 사용하여 진균 독소 오염의 부량위한 강력한 방법을 개발했다.
Abstract
에 의해 입자의 썩어가는 씨앗 – 감염 곰팡이는 인간과 동물 건강에 심각한 위험을 언급하지 않기로, 시리얼 생산 세계적으로 가장 큰 경제적 어려움 중 하나가 포즈. 시리얼 생산 중에서 옥수수는 곡물 무결성 및 진균 독소의 종자 오염의 병원체 유발 손실로 인해 거의 틀림없이 가장 영향을받는 작물이다. 옥수수 재배자 및 식품 및 사료 프로세서를위한 두 가지 가장 널리 사용하고 문제가 mycotoxins는 각각 Aspergillus flavus와 Fusarium의 verticillioides 제작한 아플라톡신과 fumonisin, 수 있습니다.
분자 식물 – 병원균 상호 작용의 최근 연구에 곰팡이 감염 및 진균 독소 오염 1,2,3,4,5,6으로 식물 반응과 관련된 구체적인 메커니즘을 이해 약속을 증명하고있다. 많은 실험실이 식물 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 커널 assays를 사용하고 있기 때문에, 서로 다른 생물 학적 매개 변수를 quantifying위한 표준화된 방법에 필요하므로,이다른 실험실에서 결과를 비교 해석될 수 있습니다. 씨앗에 대한 정량 분석을위한 강력하고 재현할 수단을 위해서는 곰팡이 성장, 바이오 매스 및 진균 독소 오염을 수치 인 – 실험실 커널 assays와 후속 방법을 개발했습니다. 네 소독 옥수수 커널은 곰팡이 서스펜션 (10 6)와 함께 유리 튜브 안에 주사하고 미리 정해진 기간 동안 incubated됩니다. 샘플 튜브 그러면 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC), AflaTest fluorometer 방법을 사용하여 아플라톡신의 부량, 그리고 HPLC에 의한 fumonisin의 부량하여 hemocytometer, ergosterol 기반의 바이오 매스 분석하여 conidia의 열거를 위해 선택됩니다.
Protocol
1. 옥수수 커널 Bioassay 두 주 전에, 문화 28의 감자 덱스 트로 오스 한천 배지 (PDA)에서 곰팡이 병원균 ° C. 그들이 bioassay의 튜브의 바닥과 수준, 50 ML 팔콘 튜브의 위치를 누워 있도록 선호 평평 비슷한 크기와 모양으로 커널을 선택합니다. 선택된 커널은 유사한 종자 연령 및 신진 대사 조성을 위해 동일한 환경에서 동시에 생산된 것이어야합니다. 6 % 나트륨 차아 염소 산…
Discussion
<p class="jove_content"> 여기에 설명된 방식은 광범위하게 테스트 및 곰팡이 식민지, sporogenesis 및 mycotoxins의 생산을위한 같지는 결과의 세대에 견고한 것으로 입증되었습니다. 또한, 이러한 방법은 mycotoxigenic 진균류 (예 : 땅콩, 밀, 면화, 피스타치오 등)과 오염에 민감한 다른 식물 종 씨앗에 적용할 수 있어야합니다. 유능한 식물 – 병원균 상호 작용 분석을 위해, 씨앗은 생명을 유지하는 것이 필수적입니다. 씨앗의 생?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 기술 지원을 위해 브랜든 Hassett과 카를로스 오르 티즈 감사드립니다. 이 작품은 박사 마이클 Kolomiets에 NSF 교부금 IOB-0544428, IOS-0951272, 그리고 IOS-0925561에 의해 지원, 그리고 식량 농업 USDA의 국립 연구소 (NIFA), AFRI 공장 사육 및 교육 그랜트 # 2010-85117하여 -20539 Drs 있습니다. 세스 머레이, 토마스 Isakeit, 그리고 마이클 Kolomiets.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
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Tags
QuantificationFungal ColonizationSporogenesisMycotoxinsKernel BioassaysSeed-infecting FungiCereal ProductionMaizePathogen-induced LossesGrain IntegrityMycotoxin Seed ContaminationAflatoxinFumonisinAspergillus FlavusFusarium VerticillioidesMolecular Plant-pathogen InteractionsStandardized MethodQuantifying Biological ParametersCross-interpretationKernel AssaysQuantitative AnalysesFungal GrowthBiomassMycotoxin Contamination
Cite This Article
Christensen, S., Borrego, E., Shim, W., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).