फफूंद की औपनिवेशीकरण, रेणूजनक और mycotoxins का उत्पादन की मात्रा कर्नेल bioassays का उपयोग
Summary
बीज – कवक संक्रमण द्वारा अनाज फसलों की तबाही कई शोध बेहतर संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत को समझने के प्रयासों के लिये कहा गया है. एक प्रयोगशाला स्थापित करने में बीज कवक बातचीत का अध्ययन करने के लिए, हम कवक प्रजनन, बायोमास, और कर्नेल bioassays का उपयोग mycotoxin संदूषण की मात्रा का ठहराव के लिए एक मजबूत विधि विकसित की है.
Abstract
अनाज के सड़ बीज संक्रमण कवक दुनिया भर में अनाज उत्पादन के लिए सबसे बड़ा आर्थिक चुनौतियों में से एक बन गया है, मानव और पशुओं के स्वास्थ्य के लिए गंभीर जोखिम का उल्लेख नहीं है. अनाज उत्पादन के अलावा, मक्का यकीनन सबसे अधिक प्रभावित फसल, अनाज अखंडता और mycotoxin के बीज संदूषण में रोगज़नक़ प्रेरित नुकसान के लिए कारण. मक्का उत्पादकों और खाद्य और फ़ीड प्रोसेसर के लिए दो सबसे अधिक प्रचलित और समस्याग्रस्त mycotoxins aflatoxin और fumonisin, Aspergillus flavus और Fusarium verticillioides द्वारा उत्पादित, क्रमशः रहे हैं.
आणविक संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में हाल ही के अध्ययन विशिष्ट कवक संक्रमण और mycotoxin के 1,2,3,4,5,6 संदूषण के लिए संयंत्र प्रतिक्रियाओं के साथ जुड़े तंत्र को समझने में वादा दिखा दिया है. क्योंकि कई प्रयोगशालाओं कर्नेल assays के अध्ययन करने के लिए संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत का उपयोग कर रहे हैं, वहाँ अलग अलग जैविक मापदंडों को बढ़ाता के लिए एक मानकीकृत पद्धति के लिए एक की जरूरत है तो है,विभिन्न प्रयोगशालाओं से परिणाम पार से विश्लेषित किया जा सकता है. बीज पर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य साधन के लिए, हम प्रयोगशाला में गिरी assays और बाद के तरीकों को विकसित किया है कवक विकास, बायोमास, और mycotoxin संदूषण यों. चार निष्फल मक्का गुठली कांच की शीशियों में एक कवक निलंबन (6 10) के साथ inoculated हैं और एक पूर्व निर्धारित अवधि के लिए incubated रहे. नमूना शीशियों तो hemocytometer, ergosterol आधारित बायोमास विश्लेषण द्वारा रहे हैं conidia की गणना के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC), aflatoxin मात्रा का ठहराव एक AflaTest fluorometer विधि का उपयोग, और HPLC द्वारा fumonisin मात्रा का ठहराव के द्वारा चयनित.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए से ब्रैंडन Hassett और कार्लोस Ortiz, शुक्रिया अदा करना चाहूँगा. यह काम NSF के आइओबी – 0544428 अनुदान, IOS 0951272, और डॉ. माइकल Kolomiets के लिए IOS – 0925561 द्वारा समर्थित किया गया था, और खाद्य और कृषि USDA राष्ट्रीय संस्थान (NIFA), Afri प्लांट ब्रीडिंग और शिक्षा अनुदान # 2,010-85,117 -20,539 डीआरएस. सेठ मरे, थॉमस Isakeit, और माइकल Kolomiets के.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
