Kvantifisering av Fungal Colonization, Sporogenesis, og produksjon av mykotoksiner Bruk Kernel bioassay
Summary
Ødeleggelsen av korn avlinger ved frø-smitte sopp har bedt en rekke forskningsinnsats for å bedre forstå plante-patogen interaksjoner. Å studere frø-sopp interaksjoner i et laboratorium setting, utviklet vi en robust metode for kvantifisering av sopp reproduksjon, biomasse, og mykotoksin forurensning ved hjelp av kernel bioassay.
Abstract
Den råtnende av korn ved frø-smitte sopp utgjør en av de største økonomiske utfordringene til kornproduksjon i verden, for ikke å nevne alvorlige risikoer for menneskers og dyrs helse. Blant kornproduksjon, er mais uten tvil den mest berørte avling, grunnet patogen-induserte tap i korn integritet og mykotoksin frø forurensning. De to mest utbredte og problematisk mykotoksiner for mais growers og mat og fôr prosessorer er aflatoksin og fumonisin, produsert av Aspergillus flavus og Fusarium verticillioides, henholdsvis.
Nyere studier i molekylære plante-patogen interaksjoner har vist lovende i å forstå spesifikke mekanismer knyttet til plante svar soppinfeksjon og mykotoksin forurensning 1,2,3,4,5,6. Fordi mange laboratorier bruker kernel-analyser for å studere plante-patogen interaksjoner, er det behov for en standardisert metode for å kvantifisere ulike biologiske parametre, såresultater fra ulike laboratorier kan kryss-tolket. For en robust og reproduserbar måte for kvantitative analyser på frø, har vi utviklet i-lab kernel analyser og påfølgende metoder for å kvantifisere soppvekst, biomasse, og mykotoksin forurensning. Fire steriliserte mais kjerner er inokulert i hetteglass med en sopp suspensjon (10 6) og inkubert for en forhåndsbestemt periode. Smak ampuller blir deretter valgt for telling av conidia av hemocytometer, ergosterol-basert biomasse analyse av høy ytelse væskekromatografi (HPLC), aflatoksin kvantifisering ved hjelp av en AflaTest fluorometer metode, og fumonisin kvantifisering av HPLC.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Brandon Hassett og Carlos Ortiz for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av NSF tilskudd IOB-0544428, IOS-0951272, og IOS-0925561 Dr. Michael Kolomiets, og av USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri planteforedling og utdanning Grant # 2010-85117 -20539 til legene. Seth Murray, Thomas Isakeit, og Michael Kolomiets.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
