המחקר הנוכחי מתאר גישה בידול מכוון של גרימת הבחנה הלבלב של בתאי גזע עובריים אנושיים. חשיבות רבה היא מציאת תא האנדותל שיתוף תרבות מתווכת ההבשלה של תא גזע עובריים אנושיים נגזר אבות לתאי הלבלב אינסולין המבטאים.
לתאי גזע עובריים (ESC) יש שני מאפיינים עיקריים: הם יכולים להיות מופצים ללא הגבלת זמן במבחנה במצב מובחן והם pluripotent, ובכך שיש פוטנציאל להתמיין שושלות רבות. מאפיינים אלה להפוך ESCs אטרקטיבי ביותר עבור טיפול בתאי מבוסס, במהלך טיפולים משובי 1. עם זאת עבור מלוא הפוטנציאל שלו להתממש התאים צריך להיות מובחן לתוך פנוטיפים בוגרים ופונקציונלי, שהוא משימה מרתיעה. גישה מבטיחה בגרימת התמיינות הוא לעקוב מקרוב לחקות את דרך organogenesis בסביבה חוץ גופית ב. התפתחות הלבלב ידוע להתרחש בשלבים מסוימים 2, החל האנדודרם, אשר יכול להתפתח לאיברים שונים, לרבות הכבד והלבלב. אינדוקציה האנדודרם ניתן להשיג על ידי אפנון של מסלול קטרי באמצעות תוספת של Activin 3 בשילוב עם גורמי גידול מספר 4-7 </sup>. תאים האנדודרם מוחלטות ואז לעבור המחויבות הלבלב על ידי עיכוב של עיכוב קיפוד קולי, אשר יכולה להיות מושגת במבחנה על ידי תוספת של cyclopamine 8. התבגרות הלבלב מתווך על ידי אירועים מקבילים מספר כולל עיכוב של חריץ איתות, מצטבר של אבות הלבלב לתוך 3-dimentional אשכולות: אינדוקציה של כלי הדם, עד כמה שם. ללא ספק המצליחה ביותר הבשלה חוץ גופית של חברתיות ותרבותיות ובתאים הנגזרות הלבלב הושגו באמצעות עיכוב ברמה הגבוהה מאותתת על ידי תוספת DAPT 9. אמנם מוצלח, הדבר גורם התשואה הנמוכה של הפנוטיפ בוגרת עם פונקציונליות מופחתת. אזור למד פחות היא ההשפעה של תא האנדותל איתות ההתבגרות הלבלב, אשר יותר ויותר מוערך כגורם תורם חשוב ההתבגרות in-vivo הלבלב איון 10,11.
המחקר הנוכחי בוחן אפקט כזה של endothelתא ial איתות ההבשלה של האדם חברתיות ותרבותיות ובתאים הנגזרות הלבלב לייצר אינסולין תוך איון דמויי תאים. אנו מדווחים על פרוטוקול רב שלבית בידול מכוון שבו ESCs האדם הנגרמת על ידי 1 Activin יחד עם עיכוב של מסלול PI3K כלפי האנדודרם. מפרט הלבלב של תאים האנדודרם מושגת על ידי עיכוב של סוניק הקיפוד איתות ידי Cyclopamine יחד עם אינדוקציה retinoid על ידי תוספת של החומצה הרטינואית. השלב האחרון של ההתבגרות הוא המושרה על ידי איתות תא האנדותל מושגת על ידי תצורת שיתוף תרבות. בעוד בתאי האנדותל כמה נבדקו בתרבות משותפת, כאן אנו מציגים הנתונים שלנו בלב החולדה תאים אנדותל כלי הדם (RHMVEC), בעיקר על מנת להקל על ניתוח.
במהלך התפתחות הלבלב, תאים בלבלב המבדילים נמצאים בסמיכות עם לתאי אנדותל של אבי העורקים, יתר על כן, איים הלבלב הם בצפיפות vascularized לקדם חילופי מהירה של רמת הסוכר בדם והורמונים איון. לאור עובדות אלה, אין זה מפתיע כי תאי אנדותל למלא תפקיד חשוב בתהליך של organogenesis הלבלב. למרות ה…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים תמיכה פרס חדש ממציא NIH DP2 116520 ו ORAU ראלף powe שיפור Junior פרס הפקולטה.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.