İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre
Summary
Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.
Abstract
Embriyonik kök hücreler (ESC) iki ana özellikleri: onlar sonsuza kadar böylece birden fazla soy içine ayırt etmek için potansiyeli olan, farklılaşmadan in vitro koşullarda yayılır ve pluripotenttir olabilir. Bu özellikleri hücre temelli tedavi ve rejeneratif tedavi uygulamaları 1 için EKH son derece cazip kılmaktadır. Ancak gerçekleştireceği tam potansiyelini için hücreleri zor bir görev olduğunu olgun ve işlevsel fenotipleri, ayrılabilir gerekir. Hücresel farklılaşmadan indükleyecek şekilde umut verici bir yaklaşım yakından in vitro ortamda organogenezisin yolu taklit etmektir. Pankreas gelişimi karaciğer ve pankreas gibi çeşitli organlar, dönüşebilir endoderm ile başlayan, belli aşamalarına 2 oluştuğu bilinmektedir. Endoderm indüksiyon çeşitli büyüme faktörleri 4-7 ile kombinasyon halinde bir 3 aktivin ilavesi yoluyla nodal yolunun modülasyonu ile elde edilebilir </> sup. Kesin endoderm hücreleri daha sonra cyclopamine 8 ilavesi ile in vitro olarak elde edilebilir sonik kirpi inhibisyonu, inhibe ederek pankreas kararlılığını geçirilir. Pankreas olgunlaşma çentik sinyal inhibisyonu gibi çeşitli paralel etkinlikler aracılığıyla olur; pankreas progenitörlerin agregasyon 3 boyutlu kümeler halinde; vaskülarizasyonu indüksiyon; birkaç isim. En başarılı ESC türetilmiş pankreas progenitör hücrelerin in vitro maturasyonu By DAPT takviyesi 9 ile sinyalizasyon çentik inhibisyonu yoluyla elde edilmiştir. Başarılı olsa da, sınırlı işlevsellik ile olgun fenotip düşük verim elde edilmektedir. Daha az çalışma alanı giderek in-vivo pankreas adacık olgunlaşma 10,11 önemli bir faktör olarak takdir ediliyor pankreas olgunlaşmasında sinyal endotel hücre, etkisidir.
Çalışmada endotel tür etkilerini araştıranial adacık hücresi benzeri hücreler üreten insülin içine insan ESC türetilmiş pankreas progenitör hücrelerinin olgunlaşmasında sinyalizasyon. Biz insan EKH ilk PI3K yolun inhibisyonu ile birlikte bir aktivin tarafından endoderm doğru indüklenirler çok aşamalı yönettiği farklılaşma protokolü sunduk. Endoderm hücrelerinin pankreas spesifikasyonu retinoik asidin eklenmesiyle retinoid indüksiyon ile birlikte Cyclopamine tarafından sonik kirpi sinyalleşme inhibisyonu ile elde edilir. Olgunlaşmanın son aşamasında bir ko-kültür yapılandırma elde endotel hücre sinyal sayesinde meydana gelir. Birkaç endotel hücreleri ko-kültür olarak test edilirken, burada öncelikle analiz kolaylığı için, sıçan kalp mikrovasküler endotel hücreleri (RHMVEC) ile verileri sunmak.
Protocol
Discussion
Pankreas gelişimi sırasında, ayırt pankreas hücreleri aortadan endotel hücreleri ile birbirine yakın olduğu, ayrıca, pankreas adacık kan şekeri ve adacık hormonların hızlı değişimi teşvik etmek yoğun vaskülarize vardır. Bu gerçekler göz önüne alındığında, endotel hücreleri pankreas organogenez sürecinde önemli bir rol oynaması şaşırtıcı değil. Pankreas geliştirme sırasında endotel hücreleri önemi giderek takdir edilirken, embriyonik hücreler in vitro ayrımında rol?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz 116520 DP2 ve ORAU Ralph Powe Acemi Fakültesi Geliştirme Ödülü NIH Yeni Yenilikçisi Ödülü destek kabul ediyorsunuz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Concentrations |
| mTeSR1 (with supplement) | Stem cell Technologies | 5850 | |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| DMEM:F12 | Invitrogen | 11330-032 | |
| MCDB-131 | Invitrogen | 10372019 | |
| MCDB-131 (Complete) | VEC Technologies | MCDB-131 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| Activin A | R&D | 338-AC | 100ng/ml |
| Wortmannin | Invitrogen | W3144 | 1μM |
| KAAD-Cyclopamie | Sigma-Aldrich | C4116 | 0.2μM |
| All-Trans Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | 2μM |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | 30μM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | 25 μg/ml |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | 50 μg/ml |
| EGF | R&D | 236-EG | 10ng/ml |
| EndoGro | VEC Technologies | ENDOGRO | 10mg |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 90μg/ml |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1μg/ml |
| NucleoSpin RNA II | Macherey Nagel | 740955 | |
| ImProm II reverse transcription System | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR Green QPCR master mix | Straragene | 600548 | |
| Sox17 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-17355 | 1/500 |
| PDX1 goat polyclonal IgG | Santa Cruz | sc-14662 | 1/500 |
| C-Peptide Rabbit polyclonal | Cell Signaling | 4593 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | 1/1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-21447 | 1/1000 |
Table 2. Reagents and Kits.
References
- De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l’embryon humain á la médecine régénératrice de demain. Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131, 1651-1662 (2004).
- D’Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).
- Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19, 429-438 (2009).
- Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes. Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).
- Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -. P., Chipperfield, H., Tan, E. -. K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage. Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).
- Kim, S. K., Melton, D. A. Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).
- Docherty, K. Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus. Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).
- Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -. P., Ferrara, N., Melton, D. A. The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation. Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).
- Yoshitomi, H., Zaret, K. S. Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a. Development. 131, 807-817 (2004).
- Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).
- Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).
