Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex
Summary
We beschrijven de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) te handhaven. Omdat neurale codering van de locatie volgt een rug-buik organisatie binnen de MEC, deze procedures te vergemakkelijken onderzoek van cellulaire mechanismen van belang voor de navigatie en het geheugen.
Abstract
Computation in de hersenen is afhankelijk van neuronen het adequaat reageren op hun synaptische inputs. Neuronen verschillen in hun aanvulling en distributie van membraan ionenkanalen die bepalen hoe ze reageren op synaptische inputs. Echter, de relatie tussen deze cellulaire eigenschappen en neuronale functie in gedragen dieren niet goed begrepen. Een benadering voor dit probleem is om te onderzoeken topografisch georganiseerd neurale circuits waarin de positie van individuele neuronen kaarten op informatie die ze coderen of berekeningen die zij verrichten 1. Experimenten met behulp van deze aanpak stellen uitgangspunten voor afstemming van synaptische reacties onderliggende informatie-codering in zintuiglijke en cognitieve circuits 2,3.
De topografische organisatie van de ruimtelijke voorstellingen langs de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) biedt de mogelijkheid om relaties tussen cellulaire mechanismen en berekeningen tot stand iELANGRIJKE voor ruimtelijke cognitie. Neuronen in laag II van het knaagdier MEC coderen locatie met behulp van grid-achtige vuren velden 4-6. Voor neuronen vinden op dorsale posities in de MEC de afstand tussen de bakken velden die een raster vormen in de orde van 30 cm, terwijl voor neuronen geleidelijk ventrale posities deze afstand toeneemt tot meer dan 1 m. Verschillende studies hebben aangetoond cellulaire eigenschappen van neuronen in laag II van het MEC die, net als de afstand tussen rooster schieten velden ook, verschillen naar gelang van hun rug-buik-positie, wat suggereert dat deze cellulaire eigenschappen van belang zijn voor de ruimtelijke berekening 2,7-10.
Hier beschrijven we de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale omvang van het MEC waardoor onderzoek naar de topografische organisatie van de biofysische en anatomische eigenschappen van MEC neuronen te behouden. De dorsale-ventrale positie van de geïdentificeerde neurons ten opzichte van anatomische oriëntatiepunten is het moeilijk om nauwkeurig vast te stellen met de protocollen die horizontale plakjes MEC 7,8,11,12 te gebruiken, aangezien het moeilijk is om referentiepunten voor de exacte rug-buik-locatie van de slice vast te stellen. De procedures beschrijven we in staat nauwkeurige en consistente meting van de locatie van de opgenomen cellen langs de dorsale-ventrale as van het MEC en de visualisatie van moleculaire gradiënten 2,10. De procedures ontwikkeld voor gebruik met volwassen muizen (> 28 dagen) en zijn met succes toegepast bij muizen tot 1,5 jaar. Met de aanpassingen die kunnen worden gebruikt met jongere muizen of andere knaagdieren. Een gestandaardiseerd systeem van de voorbereiding en de meting zal helpen systematisch onderzoek naar de cellulaire en microschakeling eigenschappen van dit gebied.
Protocol
Discussion
Om onderzoek van MEC circuit eigenschappen die een rug-buik-organisatie hebben we hier in detail beschreven in een procedure voor het produceren van een parasagittal slice preparaat dat de dorsale-ventrale omvang van het MEC behoudt volgen vergemakkelijken.
Kritische stappen
Het verwijderen van de hersenen van het dier. Er met name op het uitoefenen van druk op de hersenen te voorkomen. Dit is belangrijker dan snelle verwijdering van de hersenen. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn bedanken de volgende voor hun steun: Commonwealth Scholarship Commissie Verenigd Koninkrijk financiering (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) en de Europese Unie Marie Curie-acties (MFN).
Materials
| Cutting ACSF(mM) | Standard ACSF(mM) | Internal solution (mM) | CASNumber | Supplier Catalogue Number | |
| NaCl | 86 | 124 | 7647-14-5 | Sigma S9888 | |
| NaH2PO4 | 1.2 | 1.2 | 13472-35-0 | Sigma 71505 | |
| KCl | 2.5 | 2.5 | 10 | 7447-40-7 | Sigma P3911 |
| NaHCO3 | 25 | 25 | 144-55-8 | Fischer S/4240 | |
| Glucose | 25 | 20 | 50-99-7 | Sigma G5767 | |
| Sucrose | 75 | 57-50-1 | Sigma S5016 | ||
| CaCl2 | 0.5 | 2 | 10043-52-4 | VWR 190464K | |
| MgCl2 | 7 | 1 | 2 | 7786-30-3 | Sigma 63020 |
| K Gluconate | 130 | 299-27-4 | Sigma G4500 | ||
| HEPES | 10 | 7365-45-9 | Sigma H3375 | ||
| EGTA | 0.1 | 67-42-5 | Sigma E4378 | ||
| Na2ATP | 2 | 34369-07-8 | Sigma A7699 | ||
| Na2GTP | 0.3 | 36051-31-7 | Sigma G8877 | ||
| NaPhospho-Creatine | 10 | 19333-65-4 | Sigma P7936 | ||
| Biocytin (optional) | 2.7 | 576-19-2 | Sigma B4261 |
Table 1. Cutting ACSF, standard ACSF and K-Gluconate internal solution recipes.
References
- O’Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
- Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O’Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
- Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
- Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -. B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
- Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
- Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -. B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).
- Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
- Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
- Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
- Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
- Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
- Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
- Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
- van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
- Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).
