GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍
Summary
OCT4의 레트로 바이러스 – 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.
Abstract
인간 배아 줄기 세포는 (hESCs) pluripotent 및 체외 질병 모델링과 의학 1 재생에 대한 소중한 휴대 소스입니다. 그것은 이전에 인간의 체세포은 4 전사 요인 자궁외 표현 (Oct4, Sox2, Klf4과 Myc)에 의해 pluripotency로 다시 프로그램 및 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs에게) 2-4이 될 수있는 것으로 나타났습니다. hESCs 마찬가지로, 인간 iPSCs는 pluripotent과 autologous 세포에 대한 잠재적인 소스입니다. 여기 GFP 함유 retroviral 등뼈 네에 복제된 네 개의 프로그래밍 요소와 인간 fibroblast 세포를 재설 정할 프로토콜을 설명합니다. 다음과 같은 프로토콜을 사용하여, 우리는 인간 ESC의 배양 조건 하에서 3~4주 인간 iPSCs를 생성합니다. 인간 iPSC의 식민지가 밀접한 형태의 hESCs 닮은 및 retroviral transgene의 입을의 결과로 GFP 형광의 손실을 표시합니다. iPSC의 식민지는 형광 microsco하에 기계적으로 분리PE는 hESCs과 비슷한 방식으로 동작합니다. 이러한 세포에서는 여러 pluripotency 유전자 및 표면 마커의 표현을 감지.
Protocol
1. 프로그래밍 요소를 표현 레트로 바이러스에 의해 프로그래밍 인간 섬유아 세포는 fibroblast 매체 (10 % 펜 / Strep과 DMEM에 FBS)에서 배양해 있습니다. 6 – 잘 접시들이 한에 감염 전에 언젠가, 플레이트 1×10 5 인간 섬유아 세포. 죽은 세포를 제거하고 신선한 fibroblast 매체 2 ML을 추가하는 매체를 기음. 5 μg / ML의 최종 농도에서 프로타민 황산염을 추가합니다. 조심?…
Discussion
iPSCs 내지 네 전사 요인 reprograms 인간 섬유아 세포의 표현. 많은 시도가 임상적으로 안전 iPSCs을 생성하는 비 통합 또는 비 유전자 접근 방법을 사용하여 인간 iPSCs를 생성하는 데 있었다. 지금까지 이러한 방법은 매우 낮은 효율을 보여 주며 재현성 11-14 향상을 위해 더욱 최적화가 필요합니다. 레트로 또는 lentiviral 방식은 쉽게 도출 및 바이러스성 통합으로 인한 안전 문제에 덜 의존 체?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 찰스 후드 재단의 의학 및 아동 보건 연구 상을 예일 학원에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| hESC medium | |||
| DMEM/F12 | 80% | Invitrogen | 11330057 |
| Knockout Serum Replacer | 20% | Invitrogen | 10828-028 |
| L-Glutamine (200 mM) | 2 mM | Invitrogen | 25030081 |
| Nonessential Amino Acids (10 mM) | 0.1 mM | Invitrogen | 11140050 |
| β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG | 0.1 mM | Invitrogen | M-6250 |
| bFGF-2 10 μg/ml | 4 ng/ml | GIBCO/BRL | GF003AF |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
| Fiboblasts Medium | |||
| DMEM | 90% | Invitrogen | 11965118 |
| FBS | 10% | Invitrogen | 10407028 |
| Penicillin/Streptomycin | 1% | Millipore | 15140-122 |
Table 1. Culture Medium
| Name | Concentration | Company | Catalogue Number |
| Antibodies | |||
| OCT4 | 1:500 | Abcam | Ab19857 |
| SSEA3 | 1:100 | Milipore | MAB4303 |
| SSEA4 | 1:100 | BD Biosciences | BD560218 |
| Tra-1-81 | 1:100 | BD Biosciences | BD560173 |
| Tra-1-60 | 1:100 | BD Biosciences | BD560174 |
| NANOG | 1:500 | Abcam | Ab21624 |
| Alexa-Flur 488 | 1:1000 | Invitrogen | A11008 |
| Alexa-Flur 555 | 1:1000 | Invitrogen | A21422 |
| DAPI | 1:5000 | Invitrogen | D1306 |
| Plasmids | |||
| pMIG-OCT4 | Addgene | 17225 | |
| pMIG-SOX2 | Addgene | 17226 | |
| pMIG-KLF4 | Addgene | 17227 | |
| pMIG-MYC | Addgene | 18119 | |
| Other Materials | |||
| Collagenase type IV | 1mg/ml | Invitrogen | 17104019 |
| Gelatin, Porcine | 0.1% | Sigma | G 1890 |
| Triton | 0.2% | Sigma | X100-500ML |
| Paraformaldehyde | 4% | Sigma | 47608 |
| BSA | 3% | American Bioanalytical | AB01800 |
| MEF feeder cells | Millipore | PMEF-N | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Equipment | |||
| Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter | |||
Table 2. Reagents and equipment.
References
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Cite This Article
Kim, K., Hysolli, E., Park, I. Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP. J. Vis. Exp. (62), e3804, doi:10.3791/3804 (2012).