Перепрограммирование соматических клеток человека в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) Использование ретровирусных вектор с GFP

Summary

Метод для создания человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) с помощью ретровируса, опосредованного эктопической экспрессии Oct4, Sox2, KLF4 и MYC описано. Практический способ определения человека IPSC колоний на основе выражения GFP также обсуждается.

Abstract

Человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) являются плюрипотентные и бесценный сотовой источники в пробирке моделирования болезни и регенеративная медицина ^1. Ранее было показано, что соматических клеток человека можно перепрограммировать на плюрипотентности по эктопической экспрессии четырех факторов транскрипции (Oct4, Sox2, Klf4 и Myc) и стать индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) ^2-4. Как и ЭСК, человеческие иПСК являются плюрипотентные и потенциальный источник аутологичных клеток. Здесь мы опишем протокол для перепрограммирования человеческих клеток фибробластов с помощью четырех факторов перепрограммирования клонировали в GFP-содержащих ретровирусных основа ^4. Используя следующий протокол, мы получаем человека иПСК в течение 3-4 недель в человеческое состояние культуры ESC. Человека IPSC колонии напоминают ЭСК по морфологии и отображения потери флуоресценции GFP в результате антиретровирусной глушителей трансгена. IPSC колонии изолированы механически под флуоресцентным microscoPE себя аналогичным образом, как ЭСК. В этих клетках, мы обнаруживаем выражение нескольких генов плюрипотентности и поверхностных маркеров.

Protocol

1. Перепрограммирование по ретровируса выражая Перепрограммирование факторы Фибробласты человека культивируют в фибробластов среды (10% FBS в DMEM с ручкой / Strep). За день до инфекции, пластина 1х10 5 фибробластов человека в одну и 6-луночного планшета. Аспирируйте среду, …

Discussion

Выражение из четырех транскрипционных факторов перепрограммирует фибробластов человека для иПСК. Многие были предприняты попытки создания человеческой иПСК с использованием не-интеграция или не-генетические подходы для получения клинически безопасной иПСК. До сих пор эти методы по…

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.