Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Summary

Ein Verfahren für die menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) über Retrovirus-vermittelte ektopische Expression von Oct4 generieren, wird Sox2, Klf4 und MYC beschrieben. Ein praktischer Weg, um menschliche iPSC Kolonien auf GFP-Expression zu identifizieren Basis wird ebenfalls diskutiert.

Abstract

Menschliche embryonale Stammzellen (HES) sind pluripotent und einen unschätzbaren zellulären Quellen für In-vitro-Krankheit Modellierung und der regenerativen Medizin ^ein. Es wurde zuvor gezeigt, dass die somatischen Zellen Pluripotenz kann im Vergleich zur Expression von vier Transkriptionsfaktoren (Oct4, Sox2, Klf4 und Myc) umprogrammiert werden und werden induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) ^2-4. Wie hESCs, sind menschliche pluripotente IPSCs und eine potentielle Quelle für autologe Zellen. Hier beschreiben wir das Protokoll für die menschliche Fibroblasten-Zellen mit den vier Umprogrammierung Faktoren in GFP-haltigen retroviralen Backbone ⁴ geklont umzuprogrammieren. Mit dem folgenden Protokoll, erzeugen wir Menschen IPSCs in 3-4 Wochen unter die menschliche Kultur ESC Zustand. Menschliche iPSC Kolonien ähneln HES in der Morphologie und zeigt den Verlust der GFP-Fluoreszenz als Ergebnis von retroviralen Transgen-. iPSC Kolonien mechanisch unter einem Fluoreszenz-Mikroskopie isoliertEW verhalten sich ähnlich wie HES. In diesen Zellen erkennen wir die Expression mehrerer Gene und Pluripotenz Oberflächenmarker.

Protocol

1. Reprogrammierung von Retrovirus Reprogrammierungsfaktoren Humane Fibroblasten in Fibroblasten-Medium (10% FBS in DMEM mit Pen / Strep) kultiviert. Einen Tag vor der Infektion, Platte 1×10 5 humane Fibroblasten in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Saugen Sie Medium, um tote Zellen zu entfernen und 2 ml frisches Medium Fibroblasten. In Protaminsulfat in einer Endkonzentration von 5 pg / ml. Vorsichtig die geeignete Menge jedes GFP-exprimierenden Virus entsprechend …

Discussion

Die Expression von vier Transkriptionsfaktoren umprogrammiert menschlichen Fibroblasten zu IPSCs. Viele Versuche wurden unternommen, um Menschen mit IPSCs nicht integrierenden oder nicht-genetische Ansätze zu einer klinisch sicheren IPSCs generieren generieren. Bisher zeigen diese Methoden extrem niedrigen Wirkungsgrad und erfordern eine weitere Optimierung, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern ^14.11. Retro-oder lentiviralen Methoden werden verwendet, um ohne weiteres abzuleiten und anzuwenden IPSCs für …

Materials

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
hESC medium
DMEM/F12	80%	Invitrogen	11330057
Knockout Serum Replacer	20%	Invitrogen	10828-028
L-Glutamine (200 mM)	2 mM	Invitrogen	25030081
Nonessential Amino Acids (10 mM)	0.1 mM	Invitrogen	11140050
β-Mercaptoethanol (14.3 M) or MTG	0.1 mM	Invitrogen	M-6250
bFGF-2 10 μg/ml	4 ng/ml	GIBCO/BRL	GF003AF
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122
Fiboblasts Medium
DMEM	90%	Invitrogen	11965118
FBS	10%	Invitrogen	10407028
Penicillin/Streptomycin	1%	Millipore	15140-122

Table 1. Culture Medium

Name	Concentration	Company	Catalogue Number
Antibodies
OCT4	1:500	Abcam	Ab19857
SSEA3	1:100	Milipore	MAB4303
SSEA4	1:100	BD Biosciences	BD560218
Tra-1-81	1:100	BD Biosciences	BD560173
Tra-1-60	1:100	BD Biosciences	BD560174
NANOG	1:500	Abcam	Ab21624
Alexa-Flur 488	1:1000	Invitrogen	A11008
Alexa-Flur 555	1:1000	Invitrogen	A21422
DAPI	1:5000	Invitrogen	D1306
Plasmids
pMIG-OCT4		Addgene	17225
pMIG-SOX2		Addgene	17226
pMIG-KLF4		Addgene	17227
pMIG-MYC		Addgene	18119
Other Materials
Collagenase type IV	1mg/ml	Invitrogen	17104019
Gelatin, Porcine	0.1%	Sigma	G 1890
Triton	0.2%	Sigma	X100-500ML
Paraformaldehyde	4%	Sigma	47608
BSA	3%	American Bioanalytical	AB01800
MEF feeder cells		Millipore	PMEF-N
Cell Lifter		Corning	3008
Equipment
Fluorescent microscopy: inverted microscope with GFP filter

Table 2. Reagents and equipment.