مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم
Summary
والسعي أساسية في بيولوجيا الخلية هو تحديد الآليات التي تكمن وراء هوية العضيات التي تجعل الخلايا حقيقية النواة. هنا نقترح طريقة لتحديد الجينات المسؤولة عن سلامة المورفولوجية والوظيفية من العضيات النباتية باستخدام المجهر مضان والأدوات التسلسل من الجيل التالي.
Abstract
هذا البروتوكول يصف مضان المجهر القائم على فحص الشتلات Arabidopsis ويصف كيفية تعيين الطفرات المتنحية التي تغير توزيع التحت خلوية من علامة محددة فلوري المفتاحية في مسار إفرازية. Arabidopsis هو نموذج قوي البيولوجية للدراسات الجينية بسبب حجم الجينوم، الوقت جيل، والمحافظة على الآليات الجزيئية بين الممالك. الصفيف التنميط الجيني كنهج لرسم خريطة للطفرة في بديل للطريقة التقليدية القائمة على المؤشرات الجزيئية هو مفيد لأنه هو أسرع نسبيا، ويمكن السماح لرسم الخرائط من المسوخ عدة في فترة زمنية قصيرة حقا. وتسمح هذه الطريقة في تحديد البروتينات التي يمكن أن تؤثر على سلامة أي عضية في النباتات. هنا، على سبيل المثال، فإننا نقترح على شاشة لخريطة الجينات مهمة لسلامة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا). نهجنا، ومع ذلك، يمكن أن تمتد بسهولة إلى غيرها من عضيات الخلية النباتية(انظر على سبيل المثال 1،2)، وهكذا يمثل خطوة هامة نحو فهم الأسس الجزيئية التي تنظم الهياكل التحت خلوية أخرى.
Protocol
Discussion
وصفها هنا لدينا متحد البؤر المجهري القائم على فحص لتحديد الطفرات endomembrane. ويمكن تمديد هذا النهج بسهولة إلى العضيات الأخرى في الخلية التي بعلامات محددة بروتين فلوري المتاحة. ويستند الشاشة على تحديد الطفرات التي تظهر توزيع الشاذة من علامة فلوري إما في العضية المستهدفة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف الدعم من جانب العلوم الكيميائية، علوم الأرض والعلوم البيولوجية شعبة، مكتب العلوم الأساسية للطاقة، ومكتب للعلوم، وزارة الطاقة الأميركية (عدد جائزة DE-FG02-91ER20021) والمؤسسة الوطنية للعلوم (MCB 0948584) (اف ب). نحن شاكرون لكارين بيرد السيدة لتحرير المخطوطة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
