Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l'identification des gènes impliqués dans des organites intégrité
Summary
Une quête fondamentale en biologie cellulaire est de définir les mécanismes qui sous-tendent l'identité des organites qui rendent les cellules eucaryotes. Nous proposons ici une méthode pour identifier les gènes responsables de l'intégrité morphologique et fonctionnelle des organites de plantes en utilisant la microscopie à fluorescence et des outils de séquençage de prochaine génération.
Abstract
Ce protocole décrit une microscope à fluorescence sur le dépistage des plants d'Arabidopsis et décrit comment cartographier des mutations récessives qui modifient la distribution subcellulaire d'un marqueur fluorescent spécifique marqué dans la voie de sécrétion. Arabidopsis est un puissant modèle biologique pour les études génétiques en raison de sa taille du génome, temps de génération, et la conservation des mécanismes moléculaires chez les royaumes. Le tableau génotypage comme une approche à la carte de la mutation en alternative à la méthode traditionnelle basée sur des marqueurs moléculaires est avantageuse car elle est relativement rapide et peut permettre à la cartographie de plusieurs mutants dans un laps de temps très court. Cette méthode permet l'identification des protéines qui peuvent influer sur l'intégrité de tout organite dans les plantes. Ici, comme un exemple, nous proposons un écran pour cartographier les gènes importants pour l'intégrité du réticulum endoplasmique (RE). Notre approche, toutefois, peut être facilement étendu à d'autres organites des cellules végétales(Voir par exemple 1,2), et représente donc une étape importante vers la compréhension de la base moléculaire qui régit d'autres structures subcellulaires.
Protocol
Discussion
Ici, nous décrit une microscopie confocale d'un dépistage pour l'identification des mutants endomembranaire. Cette approche peut être facilement étendu pour d'autres organites de la cellule pour laquelle des marqueurs spécifiques de protéines fluorescentes sont disponibles. L'écran est basée sur l'identification de mutants qui montrent une répartition aberrante du marqueur fluorescent, soit dans l'organite cible ou à organites qui ne sont pas censé contenir le marqueur. Respectivement,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le soutien de la Chimie, Géosciences et Biosciences Division, Bureau des sciences fondamentales de l'énergie, Bureau de la science, US Department of Energy (numéro de la subvention DE-FG02-91ER20021) et la National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Nous sommes reconnaissants à Mme Karen Bird pour l'édition du manuscrit.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
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