Fluorescens-mikroskopi Screening och nästa generations sekvensering: Användbara verktyg för identifiering av gener involverade i Organell Integrity
Summary
En grundläggande strävan i cellbiologi är att definiera de mekanismer som ligger bakom identiteten av organeller som gör eukaryota celler. Här föreslår vi en metod för att identifiera de gener som är ansvariga för den morfologiska och funktionella integritet växt organeller med fluorescensmikroskopi och nästa generation verktyg sekvensering.
Abstract
Detta protokoll beskriver en fluorescens-mikroskop-baserad screening av Arabidopsis plantor och beskriver hur man mappa recessiva mutationer som förändrar den subcellulära fördelningen av en märkt specifik fluorescerande markör i den sekretoriska vägen. Arabidopsis är en kraftfull biologisk modell för genetiska studier på grund av dess genom storlek, generationstid, och bevarande av molekylära mekanismer bland riken. Arrayen genotypning som en metod att kartlägga mutationen i alternativ till den traditionella metod som bygger på molekylära markörer är fördelaktigt eftersom det är relativt snabbare och kan tillåta kartläggning av flera mutanter i en riktigt kort tid. Denna metod gör det möjligt att identifiera proteiner som kan påverka integriteten hos all organell i växter. Här, som ett exempel, föreslår vi en skärm för att kartlägga gener som är viktiga för integriteten hos det endoplasmatiska retiklet (ER). Vårt tillvägagångssätt, kan dock lätt utvidgas till andra organeller växt cell(Se till exempel 1,2), och utgör därmed ett viktigt steg mot att förstå den molekylära grunden för övriga subcellulära strukturer.
Protocol
Discussion
Här har vi beskrivit en konfokal mikroskopi screening för identifiering av endomembrane mutanter. Detta tillvägagångssätt kan enkelt utvidgas till andra organeller i cellen för vilken särskilda fluorescerande proteinmarkörer finns tillgängliga. Skärmen är baserad på identifieringen av mutanter som visar en avvikande fördelning av den fluorescerande markören antingen i mål-organell eller organeller som inte är tänkta att innehålla markören. Respektive dessa mutanter representerar populationer då antin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner stöd från Chemical Sciences, geovetenskap och Biosciences Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (tilldelning antalet DE-FG02-91ER20021) och National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Vi är tacksamma för att Karen Bird för redigering av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
