Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit
Summary
Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.
Abstract
Dit protocol beschrijft een fluorescentie microscoop op basis van screening van Arabidopsis zaailingen en beschrijft hoe in kaart te brengen recessieve mutaties die de subcellulaire distributie van een specifiek gelabeld fluorescente marker in de secretieroute te wijzigen. Arabidopsis is een krachtig biologisch model voor genetisch onderzoek vanwege de grootte van het genoom, generatietijd, en behoud van de moleculaire mechanismen onder de koninkrijken. De array genotypering als een benadering van de mutatie in kaart te brengen alternatief voor de traditionele methode op basis van moleculaire merkers is voordelig omdat het relatief sneller en kunnen aan het in kaart brengen van de verschillende mutanten in een heel kort tijdsbestek. Deze methode maakt het mogelijk de identificatie van eiwitten die de integriteit van de organellen in planten kunnen beïnvloeden. Hier, als voorbeeld, stellen we een scherm om de kaart te genen die belangrijk zijn voor de integriteit van het endoplasmatisch reticulum (ER). Onze aanpak is echter gemakkelijk kan worden uitgebreid tot andere planten celorganellen(Zie bijvoorbeeld 1,2), en dus een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van de moleculaire basis gelden voor andere subcellulaire structuren.
Protocol
Discussion
Hier beschreven een confocale microscopie-screening voor de identificatie van endomembraan mutanten. Deze benadering kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere organellen van de cel die specifieke fluorescente eiwit markers zijn. Het scherm is gebaseerd op de identificatie van mutanten die een afwijkende verdeling van de fluorescerende merker hetzij het doel organel of organellen die niet bedoeld om de marker bevatten vertonen. Respectievelijk deze mutanten vertegenwoordigen populaties die hetzij het vermogen van de o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen steun van de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energy (award aantal DE-FG02-91ER20021) en de National Science Foundation (MCB 0948584) (FB). Wij zijn dankbaar voor mevrouw Karen Vogel voor het bewerken van het manuscript.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
- Marti, L. A missense mutation in the vacuolar protein GOLD36 causes organizational defects in the ER and aberrant protein trafficking in the plant secretory pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology. 63, 901-913 (2010).
- Stefano, G., Renna, L., Moss, T., McNew, J., Brandizzi, F. Arabidopsis the spatial and dynamic organization of the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus is influenced by the integrity of the c-terminal domain of RHD3, a non-essential GTPase. The Plant Journal. , (2011).
- Kim, Y., Schumaker, K. S., Zhu, J. K. EMS mutagenesis of Arabidopsis. Methods in molecular biology. 323, 101-103 (2006).
- Maple, J., Moller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Methods in molecular biology. 362, 197-206 (2007).
- Greene, E. A. Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic screen in Arabidopsis. Genetics. 164, 731-740 (2003).
- Krieg, D. R. Ethyl methanesulfonate-induced reversion of bacteriophage T4rII mutants. Genetics. 48, 561-580 (1963).
- Kovalchuk, I., Kovalchuk, O., Hohn, B. Genome-wide variation of the somatic mutation frequency in transgenic plants. The EMBO journal. 19, 4431-4438 (2000).
- Boulaflous, A., Faso, C., Brandizzi, F. Deciphering the Golgi apparatus: from imaging to genes. Traffic. 9, 1613-1617 (2008).
- Borevitz, J. Genotyping and mapping with high-density oligonucleotide arrays. Methods in molecular biology. 323, 137-145 (2006).
- Konieczny, A., Ausubel, F. M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. The Plant journal : for cell and molecular biology. 4, 403-410 (1993).
- Bell, C. J., Ecker, J. R. Assignment of 30 microsatellite loci to the linkage map of Arabidopsis. Genomics. 19, 137-144 (1994).
- Hazen, S. P., Kay, S. A. Gene arrays are not just for measuring gene expression. Trends in Plant Science. 8, 413-416 (2003).
- Hazen, S. P. Rapid array mapping of circadian clock and developmental mutations in Arabidopsis. Plant Physiology. 138, 990-997 (2005).
- Bentley, D. R. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 456, 53-59 (2008).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis. A Laboratory Manual. , (2002).
- Voelkerding, K. V., Dames, S., Durtschi, J. D. Next generation sequencing for clinical diagnostics-principles and application to targeted resequencing for hypertrophic cardiomyopathy: a paper from the 2009 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology. J. Mol. Diagn. 12, 539-551 (2010).
