Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l'identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity
Summary
Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.
Abstract
Questo protocollo descrive un microscopio a fluorescenza basato su uno screening di piantine di Arabidopsis e descrive come mappare le mutazioni recessive che alterano la distribuzione subcellulare di uno specifico tag marker fluorescente in via secretoria. Arabidopsis è un potente modello biologico per gli studi genetici a causa della sua dimensione del genoma, tempo di generazione, e la conservazione dei meccanismi molecolari tra i regni. La matrice genotipizzazione come un approccio per mappare la mutazione in alternativa al metodo tradizionale basato su marcatori molecolari è vantaggiosa poiché è relativamente veloce e può consentire la mappatura dei diversi mutanti in un lasso di tempo molto breve. Questo metodo consente l'identificazione di proteine che possono influenzare l'integrità di eventuali organello nelle piante. Qui, come esempio, si propone una schermata per mappare geni importanti per l'integrità del reticolo endoplasmatico (ER). Il nostro approccio, tuttavia, può essere facilmente estesa ad altri organelli cellulari vegetali(Si veda per esempio 1,2), e rappresenta quindi un passo importante verso la comprensione delle basi molecolari che regolano le altre strutture subcellulari.
Protocol
Discussion
Qui descritto un microscopio confocale a base di screening per l'identificazione dei mutanti endomembrane. Questo approccio può essere facilmente estesa ad altri organelli della cella per cui specifici marcatori proteici fluorescenti sono disponibili. Lo schermo si basa sulla individuazione di mutanti che mostrano una distribuzione aberrante del marcatore fluorescente o in organello bersaglio o organelli che non dovrebbero contenere il marcatore. Rispettivamente, questi mutanti rappresentano popolazioni in cui è c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo sostegno da parte Scienze Chimiche, Geoscienze e Biosciences Division, Office of Basic Sciences Energy, Office of Science, US Department of Energy (numero Premio DE-FG02-91ER20021) e National Science Foundation (MCB 0.948.584) (FB). Siamo grati a Bird sig.ra Karen per l'editing del manoscritto.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma | M0880 |
| NaOH | J.T Baker | 3722-05 |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 |
| Phytagel | Sigma | P8169-1Kg |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre | MPP92100 |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 |
| Alcohol 200 proof | Decan laboratories inc. | 2716 |
| NaOAc | J.T Baker | |
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 |
| Falcon tubes 50 mL | corning | 430290 |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | ||
| Filter paper 90mm | Whatman | 1001090 |
| Analytical Balance | Mettler Toledo AB54-S | n.a |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph polymax 1040 | n.a |
| Centrifuge | Eppendorf 5417-R | n.a |
References
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