Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs
Summary
Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l'efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l'expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d'immunohistochimie.
Abstract
Différenciation directe de souches embryonnaires (ES) des cellules dans les neurones moteurs fonctionnels représente une ressource prometteuse pour étudier les mécanismes des maladies, afin de déceler de nouveaux composés médicamenteux, et à développer de nouvelles thérapies pour les maladies du motoneurone telles que l'atrophie musculaire spinale (SMA) et la sclérose latérale amyotrophique ( SLA). De nombreux protocoles actuels utilisent une combinaison de l'acide rétinoïque (AR) et Sonic Hedgehog (Shh) à différencier souches embryonnaires de souris (MES) dans les cellules neurones moteurs 1-4. Cependant, l'efficacité de différenciation des cellules MES dans le motoneurone a seulement rencontré un succès modéré. Nous avons développé un protocole de différenciation des deux l'étape 5 qui améliore considérablement l'efficacité de différenciation par rapport aux protocoles actuellement établies. La première étape consiste à améliorer le processus en ajoutant neuralisation Noggin et les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). Noggin est une protéine morphogénétique osseuse (BMP) antagoniste et est impliqué dans l'induction neurale uneelon le modèle par défaut de la neurogenèse et les résultats dans la formation de motifs de neurones antérieure 6. FGF signalisation agit en synergie avec Noggin dans l'induction de la formation du tissu neuronal par la promotion d'une identité postérieure neurones 7-9. Dans cette étape, les cellules MES ont été sensibilisées avec Noggin, bFGF, et FGF-8 pendant deux jours pour promouvoir la différenciation vers des lignées de neurones. La deuxième étape consiste à induire la spécification des neurones moteurs. Noggin / FGF ont exposé des cellules ont été incubées avec MES RA et d'un agoniste Shh, agoniste Smoothened (SAG), pour un autre 5 jours pour faciliter la génération de motoneurones. Pour surveiller la différenciation des neurones moteurs en MES, on utilise une lignée cellulaire dérivée d'un ES eGFP souris transgénique exprimant sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones moteurs HB9 1. L'utilisation de ce protocole robuste, nous avons atteint 51 ± 0,8% de l'efficacité de différenciation (n = 3, p <0,01, t de Student-test) 5. Les résultats de immunofluorescencecoloration a montré que des cellules GFP + de expriment les marqueurs spécifiques, neurones moteurs Islet-1 et de la choline acétyltransférase (ChAT). Notre protocole de différenciation en deux étapes fournit un moyen efficace pour différencier les cellules MES dans les neurones moteurs spinaux.
Protocol
Discussion
La qualité des cellules MES est le paramètre le plus critique pour la production efficace des neurones moteurs. MES cellules doivent être cultivées sur des PMEF pour prévenir une différenciation spontanée. Ajout d'un FRV permet de maintenir les cellules MES dans un état indifférencié. Comme les cellules se divisent toutes les MES h 12-15, le milieu de culture devient rapidement épuisées et doivent être remplacés tous les jours.
Activation efficace de la voie Shh est un para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce manuscrit est dédié à la mémoire du Dr Wang Wenlan qui est décédé le 26 mai 2011. Nous remercions le Dr Douglas A. Kerr pour avoir généreusement fourni les cellules HBG3 MES utilisées dans cette étude. Ce travail a été financé par Nemours, une subvention (2 RR016472-10) dans le cadre du programme de INBRE du National Center for Research Resources (NCRR), et un prix COBRE subvention de la NCRR (5 P20 RR020173-05) pour soutenir le Centre pour la recherche pédiatrique à l'Hôpital Alfred I. duPont pour les enfants, Wilmington, Delaware, Etats-Unis.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
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