Summary
قمنا بتطوير بروتوكول جديد لتحسين كفاءة المختبر في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية. حصلت على خلايا ES متباينة الخلايا العصبية الحركية يتميز كما يتضح من التعبير عن علامات الخلايا العصبية الحركية والخلايا العصبية باستخدام تقنيات المناعى.
Abstract
تمايز الخلايا الجنينية مباشرة من (ES) الجذعية إلى الخلايا العصبية الحركية وظيفي يمثل مورد واعدة لدراسة آليات المرض، لفحص مركبات عقار جديد، وتطوير علاجات جديدة لأمراض الخلايا العصبية الحركية مثل ضمور العضلات الشوكي (SMA) والتصلب الجانبي ( ALS). البروتوكولات الحالية العديد من استخدام مزيج من حمض الريتينويك (RA)، والقنفذ الصوتي (SHH) لتمييز الماوس الجذعية الجنينية (MES) الخلايا في الخلايا العصبية الحركية 1-4. ومع ذلك، فقد اجتمع كفاءة تمايز الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية فقط مع نجاح معتدل. قمنا بتطوير بروتوكول تمايز على مرحلتين (5) التي تحسن كبير في كفاءة التمايز مقارنة مع البروتوكولات المعمول بها حاليا. فإن الخطوة الأولى هي لتعزيز عملية neuralization بإضافة رأس وعوامل نمو الخلايا الليفية (FGFs). رأس هو بروتين مخلق العظام (BMP) وخصم متورطة في تحريض العصبية 1ccording إلى النموذج الافتراضي لتكوين الخلايا العصبية والنتائج في تشكيل الزخرفة العصبية الأمامية 6. جمعية جيل المستقبل مما يشير يعمل بالتآزر مع رأس في حفز تشكيل الأنسجة العصبية من خلال تعزيز الهوية الخلفي العصبية 7-9. في هذه الخطوة، ومعبي الخلايا زارة التربية والعلم مع رأس، bFGF، وجمعية جيل المستقبل 8 لمدة يومين لتعزيز التمايز نحو الأنساب العصبية. والخطوة الثانية هي للحث على العصبون الحركي المواصفات. وحضنت رأس / FGFs تتعرض الخلايا زارة التربية والعلم من التهاب المفاصل الروماتويدي، وناهض SHH، ناهض Smoothened (SAG)، لمدة 5 أيام لتسهيل العصبون الحركي جيل. لرصد التمييز بين فوضى في الخلايا العصبية الحركية، وكنا على خط خلية ES مستمدة من eGFP الماوس المعدلة وراثيا التعبير تحت سيطرة المروج الخلايا العصبية الحركية محددة Hb9 1. باستخدام هذا البروتوكول قوي، حققنا 51 ± 0.8٪ من كفاءة التمايز (ن = 3؛ ف <0.01، الطالب في اختبار t) 5. نتائج من مناعيوأظهرت أن تلطيخ GFP + الخلايا التعبير عن الخلايا العصبية الحركية علامات محددة، وجزيرة 1 والكولين أسيتيل (الدردشة). بروتوكول لدينا تمايز على مرحلتين ويوفر وسيلة فعالة للتمييز بين الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري.
Protocol
1. الخطوة 1: الفأر الخلية الجذعية الجنينية الثقافة (MES) (التوقيت: 3 أيام)
1. الطلاء الأساسي الليفية الفأر الجنينية (PMEF)
- معطف 4 زراعة الأنسجة 100 ملم مع أطباق الجيلاتين للالتصاق PMEF. إضافة 8 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ (StemCell تقنيات) إلى كل طبق واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الزائدة الجيلاتين من الأطباق. لا شطف الأطباق.
- تمييع 1 قارورة من Mitomycin C-المعطل PMEF (ميليبور) الذي يحتوي تقريبا. 5 × 10 6 الخلايا في 40 مل من وسائل الاعلام PMEF (انظر الوصفة في الجدول رقم 1)، وطبق على 4 100 ملم أطباق زراعة الأنسجة. وPMEF توفير طبقة المغذية للخلايا زارة التربية والعلم.
- وينبغي مطلي PMEF على الأقل قبل يوم واحد مشيرا الى مزارع الخلايا زارة التربية والعلم. ويمكن استخدام PMEF تصل الى 1 بعد أسبوع من الطلاء.
2. تصفيح خلايا زارة التربية والعلم
لرصد كفاءة تمايز الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية، كنا HBG3، خط خلية ES مستمدة من الماوس المعدلة وراثيا معربا عن eGFP تحت سيطرة المروج الخلايا العصبية الحركية Hb9 محددة.
- تذويب 1 قارورة من الخلايا زارة التربية والعلم HBG3 (حوالي 1 × 10 7، ساهم الدكتور دوغلاس كير، جامعة جونز هوبكنز) في 37 درجة مئوية حمام الماء. أضف 5 مل من وسائل الإعلام وفاق (انظر الوصفة في الجدول رقم 1) في أنبوب 15 مل وتدور إلى أسفل الخلايا في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- نضح طاف والخلايا resuspend زارة التربية والعلم في 20 مل من وسائل الاعلام وفاق مع عامل واضاف طازجة المثبطة اللوكيميا (LIF) بتركيز نهائي من 10 نانوغرام / مل. ملاحظة: ينبغي أن يضاف LIF في اليوم من استخدام ومطلوب للحفاظ على الخلايا زارة التربية والعلم في حالة غير متمايزة.
- إزالة 10 مل وسائل الاعلام PMEF من PMEF في كل طبق ويضاف 10 مل من تعليق ES خلية HBG3 إلى كل طبق.
- 24 ساعة بعد الطلاء، وخلايا زارة التربية والعلم تشكل مستعمرات صغيرة ومماثلة في الحجم إلى المستعمرة التي أشار إليها رأس السهم في الشكل 1B. 72 ساعة بعد تصفيح، coloniوفاق الزيادة في الحجم، والعديد من كونها ما يقرب من 100 ميكرون في القطر (1B الشكل الذي يشار إليه بواسطة سهام). هذه الخلايا جاهزة للتمايز. يجب أن يتم استبدال وسائل الإعلام يوميا للحفاظ على تكاثر الخلايا.
2. الخطوة 2: الحث العصبي (التوقيت: 2 أيام)
للحث على تمايز الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية، والخلايا زارة التربية والعلم يجب أن يتم فصلها عن PMEF وزراعتها في بيئة تعليق. وتستخدم قوارير المغلفة الجيلاتين لفصل PMEF من الخلايا زارة التربية والعلم.
- عندما المستعمرات زارة التربية والعلم على استعداد لتحريض العصبية (كما هو محدد يوم التمايز 0)، ومعطف 2 T150 قوارير مع الجيلاتين 0.1٪ (18 مل / قارورة) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم إزالة الجيلاتين الزائد وغسل مع 1X ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني. ملاحظة: كل ثقافة صحن 100 مم وسوف تحتاج إلى واحد T150-الجيلاتين قارورة المغلفة لفصل PMEF.
- إزالة بعناية وسائل الاعلام من قبل طموح، والتأكد من عدم طرد مستعمرات فضفاضة يعلق. إضافة 10 مل موجز برنامج تلفزيونيلاي ومن ثم إزالة بواسطة طموح لاستكمال الخطوة غسيل.
- لفصل الخلايا زارة التربية والعلم من PMEF، إضافة 0.25٪ التربسين / EDTA (3 مل / طبق، StemCell تقنيات)، واحتضان لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا الجذعية وPMEF فصل من لوحة. إضافة 15 مل من وسائل الاعلام وفاق جديد بدون LIF والخلايا الماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات (حوالي 15-20 مرة). ثم، إضافة إلى قارورة 0.1٪ T150 الجيلاتين المغلفة واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد مرور فترة الحضانة، وينبغي أن PMEF نعلق على سطح خلايا ES مهيلم بينما ينبغي أن يتحرك. جمع الخلايا العائمة زارة التربية والعلم في أنبوب 50 مل.
- تدور باستمرار في 800 دورة في الدقيقة والخلايا resuspend في 10 مل من متوسطة التمايز العصبية (انظر وصفه في الجدول 1).
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم طبق ما يقرب من 2 × 10 6 خلايا زارة التربية والعلم على طبق 100 ملم ثقافة جرثومية أو تعليق. هذه اللوحات تسمح نمو الثقافات تعليق وتعزيز تشكيل هيئات مضغي الشكل (EBS).
- على فارقيوم نشوئها 1، خلايا زارة التربية والعلم تشكل مجاميع صغيرة عائمة (EBS) التي تكون مرئية تحت المجهر ضوء. أي PMEF المرحل نعلق على طبق. نقل الخلايا تعليق وسائل الاعلام في أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي على سرعة منخفضة (500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق. نضح وسائل الإعلام بعناية، إضافة 10 مل من جديد متوسطة التمايز العصبية إلى EBS مكعبات، ثم لوحة خلايا في طبق بكتيرية جديدة. بالإضافة إلى تجديد وسائل الإعلام، وهذه الخطوة تزيل أي PMEF التي تحمل أكثر من الخطوة السابقة.
- في يوم التمايز 2، EBS على استعداد ليكون ذلك حافزا إلى الخلايا العصبية الحركية.
3. الخطوة 3: العصبون الحركي مواصفات (توقيت: 5 أيام)
- في يوم التمايز 2، دوامة الطبق والثقافة، ونقل وسائل الإعلام وEBS في أنبوب 15 مل. اسمحوا EBS تسوية عن طريق الجاذبية (~ 10 دقائق) أو عن طريق الطرد المركزي على سرعة منخفضة (500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق.
- نضح المتوسطة بعناية وEBS resuspend في 10 مل من تمايز الخلايا العصبية الحركية (القوات المتعددة الجنسيات) متوسطة (انظر وصفه في
- في يوم التمايز 7، وينبغي أن يكون EBS حوالي 150 حتي 200 ميكرون في القطر، ويجب أن يعبر عن إشارات قوية GFP (الشكل 1C). هذه EBS مستعدون لأن تنفصل ومطلي على poly-DL-ornithine/laminin أطباق مطلية أو coverslips.
4. الخطوة 4: إعداد Coverslips المغلفة Poly-DL-ornithine/laminin (التوقيت: 2 أيام)
قبل يومين من الفصل بين EBS (أي في يوم التمايز 5)، وإعداد coverslips poly-DL-ornithine/laminin-coated.
- مكان 12 ملم coverslips جولة (وارنر الآلات) في الجزء السفلي من لوحة 24-جيدا. حل 25 ملغ بولي DL-الأورنيثين (سيغما الدريخ) في 25 مل، مزدوج عقيم الماء المقطر (د 2 H 2 O) للحصول على حل سهم 10X (1 ملغ / مل). عندما جاهزة للاستخدام، وجعل التخفيف 1/10 من بولي DL-الأورنيثين مع د 2 H 2 O للحصول على تناسقالتموينية من 100 ميكروغرام / مل. إضافة 0.5 مل إلى كل بئر من لوحة 24-جيدا واحتضان في 4 درجات مئوية ليلة وضحاها.
- في اليوم التالي (يوم التمايز 6)، ونضح بولي DL-الأورنيثين والسماح لوحات والغطاء زلات الهواء الجاف في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة. شطف الآبار لوحة مع 2 د H 2 O ثلاث مرات. اسمحوا الجافة الهواء لمدة ساعة أخرى.
- حل 1 ملغ الماوس laminin (ميليبور) في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X المثلجة الباردة إلى جعل 100X حل الأوراق المالية (200 ميكروغرام / مل). عندما جاهزة للاستخدام، وجعل 1/100 التخفيف في برنامج تلفزيوني 1X المثلجة الباردة (2 ميكروغرام laminin / مل). إضافة 0.5 مل / بشكل جيد في لوحة 24-جيدا واحتضان في 4 درجات مئوية ليلة وضحاها. قبل خلايا البذر، يجب إزالة laminin الزائدة والآبار تشطف مع 1X مرتين في برنامج تلفزيوني. ويمكن تخزين Coverslips في المتوسط الفرقة المتعددة الجنسيات (0.5 مل / جيد).
5. الخطوة 5: أكسون الاستطالة (التوقيت: 2 أيام)
- في يوم التمايز 7، جمع EBS في أنبوب 15 مل، والسماح لتسوية EBS (حوالي 3 دقائق). نضح وسائل الاعلام وإعادة S-uspend EBS في برنامج تلفزيوني. السماح لتسوية EBS ثم نضح في برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 3 مرات. إضافة 1 مل من Accumax (ميليبور) إلى EBS، مزيج بلطف واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم نضح Accumax الزائدة التي تغطي EBS.
- إلى فصل EBS أضف 3 مل من الفرقة المتعددة الجنسيات المتوسطة. الماصة صعودا وهبوطا 20 مرة باستخدام 1 مل إيبندورف micropipette (الأزرق TIP) لتعطيل EBS. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل تعليق خلية إلى أنبوب ملم مع 12x75 خلية مصفاة قبعة دينار بحريني (فالكون) للحصول على تعليق خلية واحدة. كرر هذه الخطوة مع تفكك كتل المتبقية والخلايا التي يحتفظ بها مرشح وذلك لإثراء العائد من خلايا مفردة. وستقام المباراة النهائية تعليق خلية واحدة من 6 مل.
- مزيج بلطف هذا التعليق خلية واحدة ثم عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تمييع الخلايا في وسط الفرقة المتعددة الجنسيات (تستكمل مع 10 نانوغرام / مل من كل عامل التغذية العصبية، GDNF، CNTF، و NT-3) إلى كثافة 2x10 5 خلايا لكل مل. إضافة تعليق خلية (0.5 مل / أيضا) إلى 24 جيد لوحات تحتوي على ص.coverslips ly-DL-ornithine/laminin المغلفة (المعد سابقا كما هو موضح أعلاه). الخلايا المتمايزة neurites تمديد لفترة طويلة بعد 2 أيام في ثقافة (1D الشكل).
6. ممثل النتائج
رقم 1A يظهر الخطوط العريضة للبروتوكول. في الخطوة 1، تزرع الخلايا زارة التربية والعلم في PMEF وتستكمل مع LIF لمنع التمايز عفوية. بشكل عام، غير متمايز المستعمرات زارة التربية والعلم وجولة والمدمجة، وحددت بوضوح الحواف. المستعمرات ليست على اتصال مع بعضها البعض. عادة، ينبغي تقسيم الخلايا زارة التربية والعلم في نسبة 01:04 كل 2 ~ 3 أيام. ومع ذلك، فإن كل خط الخلية الفردية تنمو بمعدل مختلف، ويجب أن تحدد نسبة تقسيم تجريبيا. الأسهم في الشكل 1B تدل على مظهر نموذجي زارة التربية والعلم من الخلايا بعد زراعتها على طبقة المغذية PMEF لمدة 3 أيام. هذه المستعمرات هي كبيرة (50-100 ميكرون في القطر) ولكن لا تزال تحافظ على حافة جولة ومحددةق. في هذه المرحلة المستعمرات مستعدون للتمايز أو ثقافة فرعية. رأس السهم في الشكل 1B يظهر مستعمرة زارة التربية والعلم الصغيرة التي تجد عادة 24 ساعة بعد الطلاء. بعد أربعة أيام من الطلاء، وخلايا زارة التربية والعلم تصبح متضخمة. يظهروا مظهر بالارض وفقدان حدود معينة، مشيرة إلى أنها بدأت في التفريق. مثل هذه الخلايا ليست الأمثل لالتمايز في الخلايا العصبية.
للتمييز بين الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية، والخلايا زارة التربية والعلم بحاجة لزراعتها في ظروف تعليق للسماح تشكيل المجلس التنفيذي. في الخطوة 2، يتم نقل الخلايا ES على سطح الثقافة من دون طبقة وحدة التغذية لتشجيع تشكيل المجلس التنفيذي. في هذه الخطوة، يتم تحضين هم في متوسط التفاضل العصبية تستكمل مع رأس، bFGF، وجمعية جيل المستقبل 8 أيام لمدة 2 إلى الخلايا مباشرة إلى نسب العصبية. ويمكن ملاحظة صغيرة EBS تحت المجهر في يوم 1 من التمايز. ينبغي أن تكون عائمة في المتوسط. ويمكن أيضا المرحل PMEF يمكن العثور عليها في يوم 1من التمايز ويجب ازالته. هذه الخلايا التمسك أطباق الجرثومي حتى يتم القضاء عندما يتم passaged EBS على طبق بكتيرية جديدة. وهكذا، بعد يوم 2 من التمايز، ينبغي النظر PMEF قليلة أو معدومة في صحن الثقافة. في الخطوة 3، واصلت نقل EBS إلى أطباق جديدة ينبغي أن تكفل إزالة أي PMEF المتبقية. تستزرع EBS في الخلية العصبية وسائل الاعلام للسيارات (الفرقة المتعددة الجنسيات) التفاضل تستكمل مع RA و ش م خ لمدة 5 أيام للتمييز بين الخلايا في الخلايا العصبية الحركية. خلال ثقافة، EBS تستمر في النمو من حيث الحجم ويمكن رؤيتها بالعين المجردة في يوم التفاضل 3 ~ 4. الشكل 1C يظهر مظهر المجهري للEBS يوم التمايز 7. وخلافا للخلايا غير متمايزة، EBS تظهر مضان قوي بسبب التعبير عن GFP. هذه هي EBS متباينة على النحو الأمثل وجاهزون للانفصال. وأظهر التدفق الخلوي ان 51٪ ± 0.8٪ من الخلايا من EBS فصلها قد تختلف في GFP معربا عن الخلايا 5. في (5)، الخطوة ثقافة الESE الخلايا العصبية الحركية في وجود GDNF، CNTF، عامل التغذية العصبية، وNT3 النتائج في توسيع نطاق التوقعات محور عصبي طويل. 1D يوضح الشكل مظهر من الخلايا التمييزية، 2 بعد أيام من الطلاء EBS فصلها. لاحظ neurites طويلة تمتد من الهيئات خلية من خلايا مطلي. تلطيخ مناعي يدل على أن الخلايا + GFP تعبر عن علامة عموم العصبية (neurofilament متوسطة السلسلة) واثنين من المحركات علامات العصبية محددة، (جزيرة-1 والكولين أسيتيل، الشكل 2).
الشكل 1. تمايز الخلايا زارة التربية والعلم في الخلايا العصبية الحركية (صورة معدلة من وو وآخرون. 5). أ) خطة للبروتوكول تمايز الخلايا من زارة التربية والعلم إلى الخلايا العصبية الحركية. B) مشوه خلايا زارة التربية والعلم تشكل مستعمرات مستديرة حول الجزء العلوي من طبقة الخلايا الليفية التغذية. لديهم ضعف التعبير GFP. ج) تم فصل الخلايا زارة التربية والعلم من الطبقات الفرعية وcultuأحمر على التعلق أطباق منخفضة لتشكيل EBS. خلال اليومين الأولين من عملية التمايز، وتعرض الخلايا إلى 50 نانوغرام / مل رأس، و 20 نانوغرام / مل bFGF، و 20 نانوغرام / مل FGF-8. في وقت لاحق، والتي يسببها لهم تميز مع حامض الريتينويك 1 ميكرومتر و 1 ميكرومتر ناهض القنفذ الصوتي SAG لمدة 5 أيام. وأعرب خلايا متمايزة زارة التربية والعلم قوي مضان GFP. D) بعد 7 ايام التمايز، وكانت EBS فصلها ومطلية على لوحات مطلية poly-DL-ornithine/laminin. تمديد الخلايا المتمايزة العمليات العصبية لفترة طويلة بعد 2 أيام في الثقافة. شريط مقياس = 200 ميكرون. MN = العصبون الحركي. B، C و D هي صور مشرقة وحقل B '، C' و 'D هي صور مضان المقابلة.
الشكل 2. توصيف الخلايا العصبية الحركية زارة التربية والعلم الخلية المشتقة. وكان تلطيخ المناعي لسلسلة المتوسطة neurofilament (NF-M، الحمراء)، والدردشة (الحمراء)، وجزيرة 1 (الحمراء) تتزامن مع GFP (الخضراء) EXPRession. دابي (الأزرق) كانت تستخدم لتحديد نوى. شريط النطاق = 50 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نوعية الخلايا زارة التربية والعلم هو المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لجيل من كفاءة الخلايا العصبية الحركية. ويجب أن زراعة الخلايا زارة التربية والعلم في PMEF لمنع التمييز عفوية. بالإضافة إلى ذلك من LIF يساعد في الحفاظ على خلايا زارة التربية والعلم في حالة غير متمايزة. كما الخلايا زارة التربية والعلم تقسيم كل ح 12-15، ثقافة المتوسط يصبح المنضب بسرعة، ويجب أن يتم استبداله يوميا.
التنشيط الفعال للمسار SHH معلمة الأساسية اللازمة للحث على العصبون الحركي المواصفات. كانت جميعها SHH بروتين (R & D النظام)، ويشير SHH منبهات مثل ناهض سمو HhAg1.3 (Curis، وشركة)، purmorphamine (Calbiochem)، و SAG (كيماويات EMD) تستخدم لتشجيع تشكيل الخلايا العصبية الحركية 1-3 ، 10،11. وجدنا ش م خ ليكون أكثر فعالية من جزيء purmorphamine في تمييز الخلايا نحو النمط الظاهري العصبية الحركية 5. 1 - purmorphamine ميكرومتر 2.5 مع RA 1 ميكرومتر أبدا أعطى كفاءة التفريق بين أكثر من 20٪. لكنفي أيدينا وقدم مجموعة من 1 ميكرومتر من التهاب المفاصل الروماتويدي و1 ميكرومتر من SAG الكفاءة التفريق بين ما يقرب من 25٪ في الإجراءات دون خطوة الاستقراء العصبية.
لمزيد من تعزيز كفاءة التمايز، نضيف 2-يوم خطوة الاستقراء العصبي قبل لمواصفات المحرك خطوة الخلايا العصبية. هذا النهج يستفيد من حقيقة أن كلا من رأس ويشير صندوق الأجيال القادمة حاسمة بالنسبة لمرحلة مبكرة من الاستقراء العصبية الخلايا الجنينية عندما يدخل لأول مرة نسب العصبية 6-9. بالإضافة إلى الحث العصبية، وجمعية جيل المستقبل مما يشير الى يحافظ على الثقافات والخلايا العصبية السلائف. overexpression من Fgf8 في المخ الأوسط النامية يؤدي إلى زيادة هائلة في عدد السكان السلائف العصبية في منطقة البطين 12. مزيج من FGFs ورأس يعمل بالتآزر في حفز تشكيل الأنسجة العصبية من خلال تعزيز الهوية الخلفي العصبي 9. وبالتالي تم تصميم 2-يوم خطوة الاستقراء العصبية لتوجيه الخلايا زارة التربية والعلم من أجلنسب العصبية قبل الشروع في عملية تحديد الخلايا العصبية الحركية.
بروتوكول الموصوفة هنا هو تعديل وتعزيز بروتوكول الأصلي أنشئت سبق وصفها 1. على الرغم من أن الجدول الزمني لتوليد الخلايا العصبية الحركية هو نفسه، وحققنا عددا من التعديلات لتبسيط الإجراءات وتحسين العائد من الخلايا العصبية الحركية. وذلك بإضافة خطوة الاستقراء العصبية في البروتوكول التمايز، ونحن قادرون على زيادة كفاءة التمايز من 25٪ إلى 50٪. بروتوكول لدينا يوفر نهج فعال لتخصيب الخلايا العصبية الحركية المستمدة من الخلايا زارة التربية والعلم. لا يمكن أن الخلايا العصبية الحركية يمكن الحصول عليها من المرضى SMA وصحة الفقراء من الخلايا العصبية الحركية الأولية من الفئران SMA يحول دون عزل خلايا كافية كمية ونوعية ونقاء إلى إجراء تحليلات كمية من البروتينات المتضررة في هذا المرض. باستخدام هذا البروتوكول خلية زارة التربية والعلم، كنا قادرين على الحصول على الخلايا العصبية المحركة سكان تشيوان كافيةtity والنقاء لدراسة البروتين لتحديد المسارات الجزيئية أثرت في ضمور العضلات الشوكي 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وتكرس هذه المخطوطة لذكرى الدكتور Wenlan وانغ الذي وافته المنية يوم 26 مايو، 2011. نشكر الدكتور دوغلاس كير لتوفير بسخاء HBG3 الخلايا زارة التربية والعلم المستخدمة في هذه الدراسة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل Nemours، منحة (2 RR016472-10) في إطار برنامج INBRE من المركز الوطني للبحوث الموارد (NCRR)، وجائزة المنحة كوبر من NCRR (5 P20 RR020173-05) لدعم مركز طب الأطفال في مستشفى بحوث ألفريد دوبون الأول للأطفال، ويلمنجتون في ديلاوير، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMEF | EMD Millipore | PMEF-H | N.A. |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | EMD Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | EMD Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| DMEM | Stem Cell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | Stem Cell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Millipore | 566660 | 1 μM |
| ES-Cult Basal Medium-A | Stem Cell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | Stem Cell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | Stem Cell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | EMD Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | Stem Cell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercapt–thanol | EMD Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation | |||
| 0.1% Gelatin | Stem Cell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | EMD Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | EMD Millipore | SCR006 | N.A. |
| N.A. = Non-applicable | |||
| Table 2. Reagents for coating and dissociation | |||
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
