הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים
Summary
אנחנו מדגימים את הטכניקה הבסיסית מולקולרי מהנדס ולהתפתח סינתטיים Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) טיפול וקטורים גנים באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כלליות ודוגמאות נציג לבחירת וניתוח של capsids chimeric בודדים בעלי תכונות משופרות על תאים היעד בתרבות או בעכברים.
Abstract
Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) וקטורים מהווים חלק מכלי הרכב החזקים ביותר ומבטיח להעברת טיפולית הגן האנושי עקב שילוב ייחודי של תכונות מועילות 1. אלה כוללים את apathogenicity של וירוסים wildtype הבסיס לבין מתודולוגיות מתקדמות ביותר לייצור גבוהה titer טוהר גבוהה, וקליניים כיתה וקטורים רקומביננטי 2. יתרון נוסף של מערכת מסוימת AAV על וירוסים אחרים הוא הזמינות של עושר טבעי של קפסיד, השונים בנכסים חיוניים עדיין יכולים להיות מהונדסים בקלות באמצעות וקטורים 1,2 פרוטוקול נפוץ. יתר על כן, מספר קבוצות, כולל שלנו פיתחו לאחרונה אסטרטגיות להשתמש באותם וירוסים טבעי כתבניות ליצירת וקטורים סינתטיים אשר גם לשלב את הנכסים של קפסיד קלט מרובים, או אשר משפרים את המאפיינים של אחת לבודד. הטכנולוגיות המתאימות כדי להשיג מטרות אלה arה-DNA או המשפחה דשדוש 3, כלומר פיצול של גנים שונים AAV קפסיד ואחריו הרכבה מחדש שלהם מבוסס על homologies חלקי (בדרך כלל> 80% עבור רוב קפסיד AAV), או להציג פפטיד 4,5, כלומר הכנסה של 7 חומצות אמינו בדרך כלל לתוך לולאה חשוף של capsid ויראלי שבו פפטיד אידיאלי מתווכת מחדש מיקוד לסוג התא הרצוי. להצלחה מקסימלית, שתי השיטות מיושמות באופן תפוקה גבוהה לפיה הפרוטוקולים הם עד בקנה מידה להניב ספריות של כ 1,000,000 קפסיד גרסאות שונות. שיבוט כל כך מורכב משילוב ייחודי של וירוסים הורים רבים (גישת ה-DNA של גרירת רגליים) או מכילה פפטיד ייחודי בתוך עמוד השדרה ויראלי זהה (גישת התצוגה פפטיד). השלב האחרון לאחר מכן הוא איטרטיבי מבחר של הספרייה כזה על תאים היעד על מנת להעשיר את capsids בודדים הממלאים את רוב או את כל הדרישות אידיאלי של תהליך הבחירה. זו האחרונה רצוי לסרקאינס לחץ חיובי, כגון גידול לסוג תא מסוים של עניין, עם סלקציה שלילית, לשם מניעת מופע של כל capsids מגיבים עם נוגדנים נגד AAV. שילוב זה מגדיל הסיכוי capsids סינתטיים ששרדו את הבחירה להתאים את הצרכים של היישום ניתן באופן סביר להניח שלא נמצאו כל AAV טבעי לבודד. כאן, אנו מתמקדים בשיטת ה-DNA המשפחה דשדוש כמו תיאורטית ו ניסיוני יותר מאתגר של שתי הטכנולוגיות. אנו מתארים ולהפגין בכל האמצעים החיוניים לייצור ובחירת גררה את רגליה ספריות AAV (איור 1), ולאחר מכן לדון את החסרונות ואת ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקולים, כי אחד צריך להיות מודע כדי להצליח עם האבולוציה AAV מולקולרית.
Protocol
Discussion
הנה, יש לנו התווה צעדים ניסיוניים חיוניים והנחיות AAV capsid הנדסת באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים ועל האבולוציה בתאים או בבעלי חיים. בעיקרו של דבר, פרוטוקולים אלה הן גרסאות סטנדרטיות של הנהלים שאנחנו דיווח לראשונה בתחום AAV בשנת 2008 3. בעוד גל של מחקרי מעקב על ידי אחרים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
החוקרים בתודה להכיר תמיכה יוצאת דופן של המעבדה שלהם, חברי הצוות ולעבוד לפי אשכול של אקסלנס CellNetworks באוניברסיטת היידלברג, כמו גם על ידי Chica והיינץ שאלר (CHS) קרן. אנו מעריכים כי אבולוציה מולקולרית AAV באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים הפך להיות פעיל מאוד בתחום מאז הפרסום הראשוני שלנו לפני שלוש שנים, ולכן מתנצל בפני כל כותבי פרסומים רלוונטיים שעבודתם לא ניתן לצטט כאן בגלל אילוצי מקום.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
