유전자 가족 걸어갔다 통해 공학 및 합성 Adeno-관련 바이러스의 진화 (AAV) 유전자 치료 벡터
Summary
우리는 molecularly 유전자 가족 걸어갔다 통해 합성 Adeno-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료 벡터를 엔지니어이며 진화하는 기본적인 기법을 보여줍니다. 더욱이, 우리는 선택과 문화 혹은 생쥐의 표적 세포에 대한 향상된 특성을 가진 각각의 키메라 capsids의 분석을위한 일반 지침 및 대표 예제를 제공합니다.
Abstract
Adeno – 관련 바이러스 (AAV) 벡터 인해 유익한 특성 1의 독특한 조합으로 치료 인간의 유전자 전달을위한 가장 강력하고 유망한 차량의 일부를 나타냅니다. 이들은 기본 wildtype 바이러스와 높은 titer, 고순도 및 임상 수준의 재조합 벡터 2의 생산을위한 고도의 방법론의 apathogenicity을 포함합니다. 다른 바이러스여 AAV 시스템의 더욱 특별한 장점은 자연스럽게 모두 쉽게 일반적인 프로토콜 1,2을 사용하여 벡터로 설계하실 수 있습니다 아직 필수 속성에 차이가 serotypes을 발생 풍부한의 가용성이다. 또한, 우리 자신을 포함한 그룹의 숫자가 최근 중 여러 입력 serotypes의 자산, 또는 어떤 분리 하나의 속성을 강화를 결합하여 합성 벡터의 생성을위한 템플릿으로 이러한 자연적인 바이러스를 사용하는 전략을 고안했습니다. 각각의 기술은 이러한 목표에게 AR를 달성하기전자 하나의 DNA 가족 걸어갔다 3 부분 homologies (일반적으로 대부분의 AAV의 serotypes을위한> 80 %), 또는 4,5 펩타이드 디스플레이, 보통 일곱 아미노산, 즉 삽입로를 기반으로 자신을 다시 조립 뒤에는 다양한 AAV capsid 유전자의 예 조각화 원하는 세포 유형에 펩타이드가 이상적으로 mediates을 다시 타겟팅 바이러스 capsid의 노출 루프. 최대 성공을위한 두 가지 방법은 프로토콜 백만 번째를 둘러싸고 뚜렷한 capsid 변종의 라이브러리를 양보하도록 상향 조정됩니다 의하여 높은 처리량 방식으로 적용됩니다. 각 클론 그 후 수많은 부모 바이러스의 고유한 조합 (유전자 걸어갔다 접근 방식)으로 구성하거나 동일한 바이러스 백본 (펩타이드 디스플레이 방식) 내에서 독특한 펩타이드를 포함합니다. 이후 마지막 단계는 대부분 또는 선택 과정에 이상적으로 모든 요구 사항을 충족 개별 capsids에 대해 풍부하게하기 위해서는 대상 세포에 이러한 라이브러리의 선택을 반복합니다. 선호 빗 후기같은 반 AAV 항체와 반응 모든 capsids의 인스턴스 제거에 대한 부정적인 선택과 관심이 특정 세포 종류,,에 성장 등 아이 네스 긍정적인 압력. 이 조합은 선택을 이겨낸 합성 capsids은 아마 모든 자연적으로 발생하는 AAV 고립에서 발견되지 않았 방식으로 주어진 어플 리케이션의 요구와 일치하는 확률이 높아집니다. 여기서는 이론적으로 두 개의 기술을 실험적으로 많은 도전과 같은 DNA의 가족 걸어갔다 방법에 초점을 맞춥니다. 우리는 설명하고 보여주 단행 AAV 라이브러리 생성 및 선택 (그림 1)에 대한 모든 필수 단계를, 다음 하나는 이에 분자 AAV의 진화와 함께 성공하기 위해 알아야 할 것이 프로토콜의 함정과 중요한 측면을 논의합니다.
Protocol
Discussion
여기서는 유전자 가족 걸어갔다 통해 그리고 세포 또는 동물의 진화에 필수적인 실험 단계와 AAV capsid 엔지니어링에 대한 지침을 마련했습니다. 본질적으로 이러한 프로토콜은 우리가 처음 2008 3 AAV 필드 내에 신고 절차의 표준 버전입니다. 다른 사람이 연구 후속의 한바탕 소동은 다양한 수법의 예를 들면, 10-13를보고했지만, 우리의 현재 버전 업 – 스케일링 및 기타 요구에 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 기꺼이 그 하이 델베르크 대학에서 우수 CellNetworks의 클러스터에서뿐만 아니라 애인과 하인즈 Schaller (CHS) 재단이 뛰어난 자신의 실험실 지원, 팀 구성원 및 작품을 인정합니다. 유전자 가족 걸어갔다 3 년 전 우리의 첫 출간 이후 매우 활동적인 분야가되므로 작업으로 인해 공간상의 제약으로 여기서 따온 수없는 관련 서적의 모든 저자에게 사과했다 통해 우리는 그 분자 AAV 진화에 감사드립니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
References
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