Fænotypisk og funktionel karakterisering af endotheliale kolonidannende celler afledt fra human Navlestrengsblod
Summary
Endotele kolonidannende celler (ECFCs) er cirkulerende endotelceller med robust klonale proliferativt potentiale, som skal vises iboende<em> In vivo</em> Beholder dannelse evne. Fænotypisk og funktionel karakterisering af udvækst endotelceller afledt fra CB er vigtigt at identificere og isolere<em> Bona fide</em> ECFCs til potentielle kliniske anvendelse i reparation af beskadigede væv.
Abstract
Mangeårige visninger af nye blodkar dannes via angiogenese, vaskulogenese, og arteriogenesis er for nylig blevet revideret 1. Tilstedeværelsen af cirkulerende endotelceller progenitorceller (EPC'erne) blev først identificeret i voksent humant perifert blod ved Asahara et al. 1997 to bringe en infusion af nye hypoteser og strategier for vaskulær regenerering og reparation. EPC'er er sjældne, men normale komponenter i cirkulerende blod, hjem til steder med blodkar dannes eller vaskulær remodellering, og lette enten postnatal vaskulogenese, angiogenese, eller arteriogenesis hovedsageligt via paracrin stimulering af eksisterende karvæggen stammer celler 3. Ingen specifik markør for at identificere en EPC er blevet identificeret, og i øjeblikket status af feltet er at forstå, at mange celletyper, herunder proangiogene hæmatopoietiske stamceller og stamceller, cirkulerende angiogene celler, Tie2 + monocytter, myeloid stamfader cells, tumorassocierede makrofager, og M2 aktiverede makrofager deltage i stimulering af angiogene proces i en række af prækliniske dyremodelsystemer og i humane patienter i talrige sygdomstilstande 4, 5. Endotele kolonidannende celler (ECFCs) er sjældne cirkulerende levedygtige endotelceller karakteriseret ved en robust klonal proliferativt potentiale, sekundære og tertiære kolonidannende evne ved genudpladning, og evne til at danne indre in vivo fartøjer ved transplantation i immundefekte mus 6-8. Mens ECFCs er blevet isoleret fra det perifere blod af sunde voksne personer, navlestrengsblod (CB) af sunde nyfødte og karvæggen for talrige humane arterielle og venøse kar 6-9, CB har den højeste frekvens af ECFCs 7, der vises den mest robuste klonale proliferativt potentiale og form holdbare og funktionelle blodkar in vivo 8, 10-13. Mens udledning afECFC fra voksne perifert blod er blevet præsenteret 14, 15, Her beskrives metoder til afledning, kloning, ekspansion og in vitro såvel som in vivo karakterisering af ECFCs fra human umbilical CB.
Protocol
Discussion
Fænotypisk og funktionel karakterisering af formodede endoteliale stamceller er vigtigt at identificere de bona fide ECFCs der er i stand til kloner og serielt re-plating i kultur og give anledning til holdbare og funktionelle implantable blodkar in vivo. Humant navlestrengsblod er beriget med ECFCs og koncentrationen af disse cirkulerende celler aftager med ældning eller sygdom 10. Nylige undersøgelser tyder på, at ECFC kan spille vigtige roller i vaskulær reparation eller regeneration…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Yoder er konsulent for EndGenitor Technologies, Inc. og medlem af bestyrelsen for Rimedion Technologies, Inc.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 |
| Ficoll-Pague | Amersham Biosciences | 17-1440-03 |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 |
| TrypLE express | Gibco | 12605 |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 |
| FcR Block | Miltenyi Biotech | 130-059-901 |
| hCD31, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555445 |
| hCD45, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555482 |
| hCD14, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555397 |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 |
| hCD146, PE conjugated | BD Pharmingen | 550315 |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555748 |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Pharmingen | 559320 |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555573 |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A |
| Anti-mouse CD31 | BD Pharmingen | 553370 |
| 0.22-μm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU05RE |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher | A38-500 |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O’Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
