Fenotypisk och funktionell karakterisering av Endotelceller kolonibildande celler härledda från humant navelsträngsblod
Summary
Endotelceller kolonibildande celler (ECFCs) cirkulerar endotelceller med robust klonal proliferativ potential som visar inneboende<em> In vivo</em> Fartyget en förmåga till bildning. Fenotypisk och funktionell karakterisering av utväxt endotelceller som härrör från CB är viktigt att identifiera och isolera<em> Bona fide</em> ECFCs för potentiella klinisk tillämpning för att reparera skadade vävnader.
Abstract
Långvariga utsikt över New blodkärl via angiogenes, vaskulogenes och arteriogenes har nyligen omdömet 1. Förekomsten av cirkulerande endotelceller stamceller (EPC) först identifierades i vuxen människa perifert blod genom Asahara et al. 1997 2 väcka infusion av nya hypoteser och strategier för vaskulär regeneration och reparation. EPCs är sällsynta, men normala komponenter i cirkulerande blod som hem till platser för blodkärlsbildning eller vaskulär remodellering, och underlätta antingen postnatal vaskulogenes, angiogenes, eller arteriogenes till stor del via olika typer av stimulering av befintlig kärlväggen härrör celler 3. Ingen specifik markör för att identifiera en EPC har identifierats, och för närvarande tillstånd av fältet är att förstå att många celltyper inklusive proangiogen hematopoetiska stam-och progenitorceller, cirkulerande angiogena celler, Tie2 + monocyter, myeloid progenitor cells, tumörassocierade makrofager, och M2 aktiverade makrofager delta i att stimulera den angiogena processen i en mängd av prekliniska djurmodellsystem och humanpatienter i ett flertal sjukdomstillstånd 4, 5. Endotelceller kolonibildande celler (ECFCs) är sällsynta cirkulerande livskraftiga endotelceller kännetecknas av en stark klonal proliferativ potential, sekundär och tertiär kolonibildande förmågan vid återutstrykning och förmåga att bilda inneboende in vivo kärl vid transplantation till immundefekta möss 6-8. Även ECFCs har framgångsrikt isolerats från perifert blod hos friska vuxna individer, navelsträngsblod (CB) av friska nyfödda barn, och kärlväggen av många mänskliga arteriella och venösa kärl 6-9, har CB den högsta frekvensen av ECFCs 7 som visas den mest robusta klonal proliferativ potential och form hållbara och funktionella blodkärl in vivo 8, 10-13. Medan härledning avECFC från perifert blod från vuxna har presenterats 14, 15, här beskriver metoder för härledning, kloning, expansion, och in vitro såväl som in vivo karakterisering av ECFCs från humana umbilikala CB.
Protocol
Discussion
Fenotypisk och funktionell karakterisering av förmodade endotelceller stamceller är det viktigt att identifiera de seriösa ECFCs som kan klonalt och seriellt Re-plating i kultur och ge upphov till långsiktiga och funktionella implanterbara blodkärl in vivo. Humant navelsträngsblod är berikad med ECFCs och koncentrationen av dessa cirkulerande celler minskar med åldrandet eller sjukdom 10. Nyligen genomförda studier tyder på att ECFC kan spela viktiga roller i vaskulär reparation e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr Yoder är konsult EndGenitor Technologies, Inc. och ledamot i styrelsen för Rimedion Technologies, Inc.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Heparin Sodium Injection, USP | APP Pharmaceuticals | 504031 |
| Ficoll-Pague | Amersham Biosciences | 17-1440-03 |
| Mixing cannula | Maersk Medical | 500.11.012 |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 |
| Defined FBS | Hyclone | SH30070.03 |
| TrypLE express | Gibco | 12605 |
| Rat type I collagen | BD Biosciences | 354236 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 |
| FcR Block | Miltenyi Biotech | 130-059-901 |
| hCD31, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555445 |
| hCD45, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555482 |
| hCD14, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555397 |
| hCD144, PE conjugated | eBioscience | 12-1449-80 |
| hCD146, PE conjugated | BD Pharmingen | 550315 |
| hCD105, PE conjugated | Invitrogen | MHCD10504 |
| Ms IgG1,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555748 |
| Ms IgG1,k antibody, PE conjugated | BD Pharmingen | 559320 |
| Ms IgG2a,k antibody, FITC conjugated | BD Pharmingen | 555573 |
| Anti-human CD31 | Dako | clone JC70/A |
| Anti-mouse CD31 | BD Pharmingen | 553370 |
| 0.22-μm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU05RE |
| Glacial acetic acid, 17.4N | Fisher | A38-500 |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 |
| IHC Zinc Fixative | BD Biosciences | 550523 |
| Sytox green reagent | Invitrogen | S33025 |
| Cloning cylinders, sterile | Fisher Scientific | 07-907-10 |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
- Asahara, T. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275, 964-967 (1997).
- Urbich, C., Dimmeler, S. Endothelial progenitor cells: characterization and role in vascular biology. Circ. Res. 95, 343-353 (2004).
- Critser, P. J., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Isolating and defining cells to engineer human blood vessels. Cell. Prolif. 44, 15-21 (2011).
- Matthias, M., David, N., Josef, N. From bench to bedside: what physicians need to know about endothelial progenitor cells. Am. J. Med. 124, 489-4897 (2011).
- Ingram, D. A. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood. 105, 2783-276 (2005).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs. J. Vis. Exp. (32), e1525 (2009).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-135 (2008).
- Critser, P. J., Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L., Yoder, M. C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc. Res. 80, 23-30 (2010).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ. Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Hofmann, N. A., Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (32), e1524 (2009).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J. Clin. Invest. 105, 71-77 (2000).
- Witting, S. R. Efficient Large Volume Lentiviral Vector Production Using Flow Electroporation. Hum. Gene. Ther. , (2011).
- Yoon, C. H. Synergistic neovascularization by mixed transplantation of early endothelial progenitor cells and late outgrowth endothelial cells: the role of angiogenic cytokines and matrix metalloproteinases. Circulation. , 112-1618 (2005).
- Dubois, C. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 55, 2232-2243 (2010).
- Medina, R. J., O’Neill, C. L., Humphreys, M. W., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5906-5913 (2010).
