Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att mäta cell styvhet. Den allmänna principen i denna strategi är att mäta membran deformation som svar på väldefinierade undertryck appliceras via en mikropipett till cellytan. Denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera biomekaniska egenskaper hos substrat-anslutna celler.
Växande antal studier visar att biomekaniska egenskaper hos enskilda celler spelar viktiga roller i flera cellulära funktioner, inklusive cellproliferation, differentiering, migration och cell-cell interaktioner. De två viktigaste parametrarna för cellulära biomekanik är cellulära deformerbarhet eller styvhet och förmåga hos cellerna att ta upp och skapa kraft. Här beskriver vi en snabb och enkel metod för att uppskatta cell styvhet genom att mäta graden av membranets deformation som svar på undertryck som tillämpas av ett glas mikropipett till cellytan, en teknik som kallas Mikropipett aspiration eller Microaspiration.
Microaspiration utförs genom att dra en glaskapillär att skapa en mikropipett med en mycket liten spets (2-50 | im diameter beroende på storleken av en cell eller ett vävnadsprov), som sedan ansluts till en pneumatisk tryckomvandlare och bringas till ett nära närhet av en cell under ett mikroskop. Närpipettspetsen nuddar en cell, ett steg med negativt tryck appliceras på pipetten av den pneumatiska tryckgivaren genererar väldefinierad tryck på cellmembranet. Som svar på tryck, är membranet aspireras in i pipetten och progressiva membran deformation eller "membran utsprång" in i pipetten mäts som en funktion av tiden. Den grundläggande principen för detta experimentella tillvägagångssätt är att graden av membranets deformation i gensvar till en definierad mekanisk kraft är en funktion av membranets styvhet. Den styvare membranet är, desto långsammare hastigheten av membranets deformation och den kortare steady-state aspiration length.The teknik kan utföras på isolerade celler, både i suspension och substrat-anslutna, stora organeller, och liposomer.
Analys utförs genom att jämföra maximala membran deformationer som uppnåtts under ett givet tryck för olika cellpopulationer eller experimentella förhållanden. En "styvhet koefficient" är estimated genom plottning den insugna längd membranets deformation som en funktion av det applicerade trycket. Vidare kan data analyseras ytterligare för att uppskatta den Youngs modul av cellerna (E), den vanligaste parametern för att karaktärisera styvhet av material. Det är viktigt att notera att plasmamembran av eukaryota celler kan ses som en tvåkomponents system där membran lipiddubbelskikt är underlied av sub-membran cytoskelettet och att det är cytoskelettet som utgör den mekaniska ställningen hos membranet och dominerar deformerbarheten av den cellulära höljet. Detta tillvägagångssätt tillåter därför sondera biomekaniska egenskaperna hos sub-membranet cytoskelettet.
Microaspiration ger en enkel och mycket reproducerbar metod för att uppskatta celler styvhet / deformerbarhet genom tillförande av undertryck till ett cellmembran och mäta membran deformerbarhet som svar på väl definierade tryck. Det utvecklades först av Mitchison och Swann (1954) för att karakterisera de elastiska egenskaperna hos sjöborre ägg för att ge insikter i mekanismerna för celldelning 21 och sedan titta på de mekaniska egenskaperna i röda blodkroppar 1. Denna metod har använ…
The authors have nothing to disclose.
Name of reagent | Company | Catalog/Model Number | Comments |
Sutter pipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | Axiovert 200M | The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities. |
Videocamera | Zeiss | AxioCam MRm | |
Image Acquisition sotware | Zeiss | AxioVision | |
Pneumatic Pressure Transducer | BioTek | DPM-1B | DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE. |
Pipette glass | Richland | Customized glass | Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter. |
DiI Dye | Invitrogen | D282 | Dissolves well in DMSO |