Mikropipette Aspirasjon av substrat-tilkoblede celler å anslå Cell Stivhet

Summary

Her beskriver vi en rask og enkel metode for å måle celle stivhet. Det generelle prinsipp ved denne tilnærmingen er å måle membran deformasjon i respons til veldefinerte undertrykk påføres gjennom en mikropipette til celleoverflaten. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere biomekaniske egenskaper substrat-tilkoblede celler.

Abstract

Økende antall studier viser at biomekaniske egenskapene til individuelle celler spiller store roller i flere cellulære funksjoner, inkludert celleproliferasjon, differensiering, migrasjon og celle-celle interaksjoner. De to sentrale parametre av cellulære biomekanikk er cellulær deformerbarhet eller stivhet og evnen av cellene til kontrakt og generere kraft. Her beskriver vi en rask og enkel metode for å anslå celle stivhet ved å måle graden av membranen deformasjon i respons til undertrykk som påføres med en glass mikropipette til celleoverflaten, en teknikk som kalles mikropipette Aspirasjon eller Microaspiration.

Microaspiration utføres ved å trekke et glass kapillær å opprette en mikropipette med en svært liten spiss (2-50 um diameter, avhengig av størrelsen av en celle eller en vevsprøve), som deretter kobles til en pneumatisk trykktransduser og brakt til en nær nærhet av en celle under et mikroskop. Nårpipettetuppen berører en celle, et trinn med undertrykk påføres pipetten ved pneumatiske trykktransduseren genererer veldefinerte press på cellemembranen. I respons til trykk, er membranen aspireres inn i pipetten og progressiv membran deformasjon eller "membran projeksjon" inn i pipetten blir målt som en funksjon av tid. Det grunnleggende prinsipp for denne eksperimentelle tilnærmingen er at graden av membranen deformasjon i respons til en definert mekanisk kraft er en funksjon av membran stivhet. Den stivere membranen er, jo saktere frekvensen av membranen deformasjon og jo kortere steady state aspirasjon length.The teknikken kan utføres på isolerte celler, både i suspensjon og substrat-tilkoblede, store organeller, og liposomer.

Analysen utføres ved å sammenligne maksimal membran deformasjoner oppnådd under et gitt trykk for forskjellige cellepopulasjoner eller eksperimentelle betingelser. En "stivhet koeffisient" er esanslås ved å plotte aspirerte lengden membran deformasjon som en funksjon av det påtrykte trykk. Videre kan dataene bli ytterligere analysert for å estimere Youngs modulus av cellene (E), den vanligste parameteren å karakterisere stivhet av materialer. Det er viktig å merke seg at plasmamembranen i eukaryote celler kan bli sett på som en bi-komponent-system hvor membran lipid bilayer er underlied av sub-membran cytoskjelettet og at det er den cytoskjelettet som utgjør mekaniske stillaset av membranen og dominerer deformerbarhet av den cellulære konvolutten. Denne tilnærmingen derfor tillater sondering de biomekaniske egenskapene til sub-membran cytoskjelettet.

Protocol

1. Trekke Glass Mikropipetter Utstyr: mikropipette Puller, Microforge. Glass: Boroscillicate glass kapillærer (~ 1,5 mm utvendig diameter, ~ 1,4 mm indre diameter). Mikropipetter trekkes med samme grunnleggende tilnærming som brukes til å forberede glass mikroelektroder for elektrofysiologiske innspillinger. Kort, er et glass kapillær oppvarmet i midten og når glasset begynner å smelte de to halv…

Discussion

Microaspiration gir en enkel og meget reproduserbar metode for å estimere celle stivhet / deformerbarhet ved å bruke negative trykk til en cellemembran, og måling membran deformerbarhet i respons til veldefinerte press. Det ble først utviklet av Mitchison og Swann (1954) for å karakterisere de elastiske egenskapene sjø-urchin egg for å gi innsikt i mekanismer for celledeling ²¹ og deretter å se på de mekaniske egenskapene i røde blodceller ^en. Denne metoden har vært brukt i flere unders?…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog/Model Number	Comments
Sutter pipette puller	Sutter Instruments	P-97
Microforge	Narishige	MF-830
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	Axiovert 200M	The microscope should be preferably equipped with 3D/deconvolution capabilities.
Videocamera	Zeiss	AxioCam MRm
Image Acquisition sotware	Zeiss	AxioVision
Pneumatic Pressure Transducer	BioTek	DPM-1B	DPM1B Pneumatic Transducer Tester can now be found by FLUKE.
Pipette glass	Richland	Customized glass	Pipettes were customized with a 1.2 inner diameter and 1.6 outer diameter.
DiI Dye	Invitrogen	D282	Dissolves well in DMSO