In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller de tidlige stadier af kræft i æggestokkene Metastase
Summary
Den mesothelial clearance analysen beskrevet her drager fordel af fluorescens mærkede celler og time-lapse video mikroskopi til at visualisere og kvantitativt at måle samspillet mellem kræft i æggestokkene flercellede kugler og mesothelial cellemonolag. Dette assay modellerer de tidlige trin af ovariecancer metastase.
Abstract
Kræft i æggestokkene er den femte hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA 1. Trods en positiv indledende respons på behandlinger, udvikle 70 til 90 procent af kvinder med kræft i æggestokkene nye metastaser, og fornyet ofte er dødelig 2. Det er derfor nødvendigt at forstå, hvordan sekundære metastaser opstår for at udvikle bedre behandlinger for mellemprodukt og sen fase ovariecancer. Ovariecancer metastase opstår, når maligne celler løsnes fra det primære tumorsted og sprede hele den peritoneale kavitet. De formidlede celler kan danne multicellulære klynger eller sfæroider, som enten vil forblive separate eller implantat på organer i den peritoneale kavitet 3 (figur 1, film 1).
Alle organerne i den peritoneale kavitet er foret med en enkelt, kontinuerlig lag af mesotelceller 4-6 (fig. 2). Imidlertid mesotelceller er fraværende nedefraperitoneale tumormasser, som afsløret ved elektronmikrografi undersøgelser af udskårne humane tumor vævssnit 3,5-7 (figur 2). Dette antyder, at mesotelceller er udelukket fra undersiden af tumormassen af en ukendt fremgangsmåde.
Tidligere in vitro-forsøg viste, at primære ovariecancerceller vedhæfte mere effektivt til ekstracellulær matrix end mesotelceller 8, og nyere undersøgelser viste, at primære peritoneale mesotelceller faktisk tilvejebringe en barriere mod ovariecancer celleadhæsion og invasion (sammenlignet med adhæsion og invasion på substrater, der ikke var dækket med mesothelial celler) 9,10. Dette tyder på, at mesotelceller virke som en barriere mod ovariecancer metastase. De cellulære og molekylære mekanismer, som ovariecancerceller overtræde denne barriere, og udelukke mesothelium har indtil for nylig, forblev ukendt.
Her beskriver vi the metode til et in vitro assay, der modellerer den interaktionen mellem ovariecancer celle sfæroider og mesoteliale celler in vivo (figur 3, film 2). Vores protokol blev tilpasset fra tidligere beskrevne fremgangsmåder til analyse af ovariale tumorer celleinteraktioner med mesoteliale monolag 8-16, og blev først beskrevet i en rapport, der viser, at ovarie tumorceller anvender et integrin-afhængig aktivering af myosin og trækkraft for at fremme udelukkelse af mesotelceller fra under en tumor sfæroid 17. Denne model udnytter tidsforløb fluorescensmikroskopi for at overvåge de to cellepopulationer i realtid, giver rumlig og tidsmæssig information om interaktionen. De ovariecancerceller udtrykker røde fluorescerende protein (RFP), medens de mesoteliale celler udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP). RFP-udtrykke kræft i æggestokkene celle sphæroider tillægger GFP-udtrykkende mesothelial monolag. Den sfæroider spredning, invaderer ogtvinge mesotelceller side skaber et hul i monolag. Dette hul er visualiseret som den negative rum (sort) i GFP-billedet. Det område af hullet kan derefter måles kvantitativt at analysere forskelle i afstand aktivitet mellem kontrol-og forsøgsdyr populationer af ovariecancer og / eller mesotelceller. Dette assay kræver kun et lille antal af ovariecancerceller (100 celler pr kugleformede X 20-30 sfæroider pr tilstand), så det er muligt at udføre dette assay under anvendelse kostbare primær tumor celleprøver. Endvidere kan dette assay kan let tilpasses til high throughput screening.
Protocol
Discussion
Den "mesothelial Clearance Assay" præsenteres her bruger time-lapse mikroskopi til at overvåge samspillet mellem kræft i æggestokkene flercellede kugler og mesothelial cellemonolag, i stor rumlig og tidsmæssig detaljer. Tidligere havde flere grupper 8-14 bruges endpoint-analyser til at vise, at ovariecancerceller lægger til og invadere ind mesothelial cellemonolag. Dette assay er enestående ved, at den anvender fluorescensmærkede celler at skelne tumorceller fra mesotelceller, således at dy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Nikon Imaging Center på Harvard Medical School, især Jennifer Waters, Lara Petrak og Wendy Laks, for uddannelse og brug af deres timelapse mikroskoper. Vi vil også gerne takke Rosa Ng og Achim Besser for værdifulde diskussioner. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant 5695837 (til M. Iwanicki) og GM064346 til fælles kontrolinstans, af en bevilling fra Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (til JSB).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
- Jemal, A. . CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model — selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
