Test in vitro avec dégagement mésothéliales que les modèles les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire
Summary
Le dosage jeu mésothéliales décrite ici prend avantage des cellules marquées par fluorescence et la microscopie vidéo time-lapse de visualiser et de mesurer quantitativement les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l'ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales. Ce test modélise les étapes précoces de métastases du cancer de l'ovaire.
Abstract
Cancer de l'ovaire est le cinquième cause de décès liés au cancer aux États-Unis 1. Malgré une réponse positive initiale à des thérapies, de 70 à 90 pour cent des femmes atteintes d'un cancer de l'ovaire développent des métastases nouvelles, et la récidive est souvent mortelle 2. Il est donc nécessaire de comprendre comment des métastases secondaires surviennent dans le but de développer de meilleurs traitements pour le cancer de l'ovaire stade intermédiaire et tardive. Métastases cancer de l'ovaire se produit lorsque les cellules malignes se détacher de la tumeur primaire et de diffuser dans toute la cavité péritonéale. Les cellules disséminées peuvent former des amas multicellulaires, ou sphéroïdes, qui soit rester seules, ou d'implants sur les organes dans la cavité péritonéale 3 (Figure 1, Film 1).
Tous les organes à l'intérieur de la cavité péritonéale sont revêtues d'un unique, continue, la couche de cellules mésothéliales 4-6 (figure 2). Cependant, les cellules mésothéliales sont absents de dessousmasses tumorales péritonéales, tels que révélés par les études d'un microscope électronique excisées de l'homme des coupes de tissus tumoraux 3,5-7 (Figure 2). Ceci suggère que les cellules mésothéliales sont exclus du dessous de la masse tumorale par un processus inconnu.
Précédent dans des expériences in vitro ont démontré que des cellules primaires de cancer de l'ovaire joindre plus efficacement à la matrice extracellulaire que de cellules mésothéliales 8, et des études plus récentes ont montré que les cellules mésothéliales péritonéales primaires fournissent effectivement un obstacle à l'adhésion cellulaire et l'invasion de l'ovaire (par rapport à l'adhérence et l'invasion sur des substrats qui n'ont pas été couverts avec des cellules mésothéliales) 9,10. Cela suggère que les cellules mésothéliales agir comme une barrière contre les métastases du cancer de l'ovaire. Les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les cellules cancéreuses de l'ovaire abus de cette barrière, et d'exclure le mésothélium ont, jusqu'à récemment, est resté inconnu.
Nous décrivons ici ela méthodologie e pour un test in vitro que les modèles de l'interaction entre les sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien et les cellules mésothéliales in vivo (figure 3, Film 2). Notre protocole a été adapté à partir des méthodes décrites précédemment pour l'analyse des interactions de cellules tumorales ovariennes avec des monocouches mésothéliales 8-16, et a d'abord été décrite dans un rapport montrant que les cellules tumorales ovariennes d'utiliser une activation de l'intégrine-dépendante de la myosine et la force de traction afin de promouvoir l'exclusion de la à partir de cellules mésothéliales en vertu d'une tumeur 17 sphéroïde. Ce modèle tire parti de time-lapse microscopie à fluorescence pour surveiller les populations de cellules deux en temps réel, fournissant des informations spatiales et temporelles de l'interaction. Les cellules cancéreuses ovariennes exprimer protéine fluorescente rouge (RFP), tandis que les cellules mésothéliales exprimer la protéine fluorescente verte (GFP). DP-exprimant sphéroïdes cellulaires de cancer ovarien joindre à la monocouche GFP-exprimer mésothéliales. La propagation sphéroïdes, envahir, etforcer les cellules mésothéliales côté créant un trou dans la monocouche. Ce trou est visualisée comme l'espace négatif (noir) dans l'image GFP. La superficie du trou peut alors être mesurée pour l'analyse quantitative des différences dans l'activité de contrôle et de jeu entre les populations expérimentales de cancer de l'ovaire et / ou des cellules mésothéliales. Ce test ne nécessite qu'un petit nombre de cellules cancéreuses de l'ovaire (100 cellules par sphéroïdes X 20-30 sphéroïdes par condition), il est donc possible d'effectuer ce test en utilisant des échantillons précieux primaires de cellules tumorales. En outre, ce test peut être facilement adapté pour le criblage haut débit.
Protocol
Discussion
Le "test Dégagement mésothéliales" présentée ici utilise la microscopie time-lapse pour surveiller les interactions de sphéroïdes multicellulaires cancer de l'ovaire et les monocouches de cellules mésothéliales, dans le détail spatial et temporel grande. Auparavant, plusieurs groupes ont utilisé des dosages 8-14 points de terminaison pour montrer que les cellules cancéreuses de l'ovaire et de joindre à envahir des monocouches de cellules mésothéliales. Ce test est unique en ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School, en particulier des eaux Jennifer, Lara Petrak et Salmon Wendy, de formation et de l'utilisation de leurs microscopes timelapse. Nous aimerions également remercier Rosa Ng et Achim Besser pour des discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH 5695837 (à M. Iwanicki) et GM064346 à ACC; par une subvention de la Dre Miriam et Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (pour ACC).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
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