Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário
Summary
O ensaio de depuração mesotelial descrito aqui leva vantagem das células marcadas com fluorescência e de microscopia de lapso de tempo de vídeo para visualizar e medir quantitativamente as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio modela os passos iniciais da metástase do câncer de ovário.
Abstract
O câncer de ovário é a quinta causa principal de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos 1. Apesar de uma resposta positiva inicial para terapias, 70 a 90 por cento das mulheres com câncer de ovário desenvolver com novas metástases, ea recorrência é muitas vezes fatal 2. É, portanto, necessário compreender como metástases secundárias surgir, a fim de desenvolver melhores tratamentos para o cancro intermediária e fase tardia do ovário. Metástase do cancro do ovário ocorre quando as células malignas destacar a partir do local do tumor primário e disseminar por toda a cavidade peritoneal. As células disseminadas pode formar aglomerados multicelulares, ou esferóides, que irá permanecer quer acopladas, ou implantes para órgãos dentro da cavidade peritoneal 3 (Figura 1, Filme 1).
Todos os órgãos dentro da cavidade peritoneal são revestidas com um único, a camada contínua de células mesoteliais 4-6 (Figura 2). No entanto, as células mesoteliais estão ausentes da parte de baixoperitoneais massas tumorais, como revelado por estudos de micrografia electrónica excisadas humanos secções de tecido de tumor 3,5-7 (Figura 2). Isto sugere que as células mesoteliais são excluídos por baixo da massa do tumor por um processo desconhecido.
Anterior, em experiências in vitro demonstraram que as células cancerosas do ovário primárias anexar mais eficientemente para a matriz extracelular do que para células mesoteliais 8, e os estudos mais recentes mostraram que os primários peritoneais células mesoteliais realmente proporcionar uma barreira para a adesão celular de ovário cancro e invasão (em comparação com adesão e invasão em substratos que não foram cobertos com células mesoteliais) 9,10. Isto sugere que as células mesoteliais actuar como uma barreira contra a metástase do cancro do ovário. Os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as células de câncer de ovário violam esta barreira, e excluir o mesotélio, até recentemente, permaneceu desconhecido.
Aqui descrevemos ªmetodologia e para um ensaio in vitro que os modelos de interacção entre esferóides de células cancerosas do ovário e células mesoteliais in vivo (Figura 3, Filme 2). O protocolo foi adaptado de métodos descritos anteriormente para analisar as interações ovarianos de células tumorais com monocamadas mesoteliais 8-16, e foi descrita pela primeira vez em um relatório mostrando que as células tumorais de ovário utilizar uma ativação dependente de integrinas de miosina e força de tração para promover a exclusão do células mesoteliais de 17 sob um tumor esferóide. Este modelo leva vantagem de lapso de tempo a microscopia de fluorescência para monitorar as populações de células de dois em tempo real, fornecendo informação espacial e temporal na interação. As células de cancro do ovário expressar vermelho proteína fluorescente (SDP), enquanto as células mesoteliais expressar a proteína verde fluorescente (GFP). RFP expressando esferóides de células cancerígenas de ovário anexar à monocamada expressando GFP-mesotelial. A propagação esferóides, invadir, eforçar as células mesoteliais de lado a criação de um buraco na monocamada. Este buraco é visualizado como o espaço negativo (preto) na imagem GFP. A área do orifício pode ser então medido quantitativamente analisar as diferenças na actividade folga entre o controlo e as populações experimentais de cancro do ovário e / ou células mesoteliais. Este ensaio requer apenas um pequeno número de células de ovário cancerosas (100 células por esferóides X 20-30 esferóides por condição), de modo que é possível realizar este ensaio usando preciosos primárias amostras de células tumorais. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para rastreio de alto rendimento.
Protocol
Discussion
O "Ensaio Apuramento mesotelial" aqui apresentado usa de lapso de tempo de microscopia para monitorar as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais, em detalhe espacial e temporal. Anteriormente, vários grupos 8-14 tinha usado ensaios de ponto de extremidade para mostrar que as células de câncer de ovário juntar-se e invadir em monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio é único na medida em que utiliza células marcadas por fluo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School, Waters especificamente Jennifer, Lara Petrak e Salmon Wendy, à formação e à utilização de microscópios seus timelapse. Gostaríamos também de agradecer a Rosa Nunes e Achim Besser pelas valiosas discussões. Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant 5695837 (para M. Iwanicki) e GM064346 a JSB; por uma concessão do Dr. Miriam e G. Sheldon Adelson Medical Research Foundation (para ICC).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
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