In vitro mesothelial Clearance Assay at modeller av de tidlige trinnene på eggstokkreft Metastase
Summary
Den mesothelial clearance analysen beskrives her utnytter fluorescensmerkede celler og time-lapse video mikroskopi for å visualisere og kvantitativt måle interaksjoner av eggstokkreft flercellede spheroids og mesothelial celle monolayers. Denne analysen modellerer de tidlige trinnene på eggstokkreft metastasering.
Abstract
Ovarian kreft er den femte største årsaken til kreft dødsfall i USA 1. Til tross for en positiv initiell respons på behandling, 70 til 90 prosent av kvinner med eggstokkreft utvikle nye metastaser, og tilbakefall er ofte dødelig to. Det er derfor nødvendig å forstå hvordan sekundære metastaser oppstår for å utvikle bedre behandlingsmetoder for middels og sent stadium eggstokkreft. Eggstokkreft metastasering oppstår når ondartede celler løsner fra den primære svulsten området og spre hele bukhulen. De spres cellene kan danne flercellede klynger, eller spheroids, som enten vil forbli fristilt, eller implantat på organer innenfor bukhulen 3 (Figur 1, Movie 1).
Alle organene i bukhulen er foret med en enkelt, sammenhengende, lag mesothelial celler 4-6 (figur 2). Men mesothelial celler er fraværende fra undersidenperitoneal tumor masser som åpenbart av elektron micrograph studier av excised menneskelige svulstvev seksjoner 3,5-7 (figur 2). Dette tyder på at mesothelial celler er ekskludert fra under tumormasse av en ukjent prosess.
Forrige in vitro eksperimenter viste at primære eggstokkreft celler feste mer effektivt å ekstracellulær matrix enn å mesothelial celler 8, og nyere studier viser at primær peritoneal mesothelial celler faktisk gir en barriere mot eggstokkreft celle adhesjon og invasjon (i forhold til heft og invasjon på underlag som ikke var dekket med mesothelial celler) 9,10. Dette ville foreslå at mesothelial celler fungere som en barriere mot eggstokkreft metastasering. De cellulære og molekylære mekanismer som eggstokkreft celler bryter denne barrieren, og utelukke mesothelium har inntil nylig, forble ukjent.
Her beskriver vi the metodikk for en in vitro metode som modeller samspillet mellom eggstokkreft celle spheroids og mesothelial celler in vivo (figur 3, Movie 2). Vår protokollen ble tilpasset fra tidligere beskrevet metoder for å analysere ovarian tumorcellelinjer interaksjoner med mesothelial monolayers 8-16, og ble først beskrevet i en rapport som viser at eggstokkene tumorceller utnytte en integrin-avhengig aktivering av myosin og trekkraft for å fremme utelukkelse av mesothelial celler fra under en svulst sfæriske legemet 17. Denne modellen tar fordel av time-lapse fluorescensmikroskopi å overvåke de to celle populasjoner i sanntid, noe som gir romlig og tidsmessig informasjon om interaksjon. De eggstokkreft celler uttrykker rød fluorescerende protein (RFP), mens de mesothelial celler uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP). RFP-uttrykke eggstokkreft celle spheroids feste til GFP-uttrykke mesothelial monolayer. Den spheroids spredning, invadere, ogtvinge mesothelial cellene til side skaper et hull i monolayer. Dette hullet er visualisert som den negative plass (svart) i GFP bildet. Arealet av hullet kan da måles til kvantitativt analysere forskjeller i clearance aktivitet mellom kontroll og eksperimentelle populasjoner av eggstokkreft og / eller mesothelial celler. Denne analysen krever bare et lite antall eggstokkreft celler (100 celler per Spheroid X 20-30 spheroids per tilstand), så det er mulig å utføre denne analysen bruker dyrebare primære tumor celleprøver. Videre kan denne analysen enkelt tilpasses for høy gjennomstrømming screening.
Protocol
Discussion
Den "mesothelial Clearance Assay" presenteres her bruker time-lapse mikroskop for å overvåke interaksjoner av eggstokkreft flercellede spheroids og mesothelial celle monolayers, i stor romlig og tidsmessig detalj. Tidligere hadde flere grupper 8-14 brukes endepunkt analyser å vise at eggstokkreft celler feste til og invadere inn mesothelial celle monolayers. Denne analysen er unik i at den bruker fluorescensmerkede celler å skille kreftceller fra mesothelial celler, slik at dynamikken i disse to…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School, spesielt Jennifer Waters, Lara Petrak og Wendy Laks, for opplæring og bruk av deres timelapse mikroskoper. Vi ønsker også å takke Rosa Ng og Achim Besser for verdifulle diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant 5695837 (til M. Iwanicki) og GM064346 til JSB, av en bevilgning fra Dr. Miriam og Sheldon Adelson G. medisinske forskningsstiftelse (til JSB).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
- Jemal, A. . CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. . SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 .
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model — selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
