Summary
死後組織学的分析をin vivoで生物発光および磁気共鳴イメージング(I)、及び(ii)この記事では、使用して、齧歯類の脳における細胞移植のマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適なシーケンスを説明しています。単一の動物でこれらの画像診断法を組み合わせることで高分解能、感度と特異性を有する細胞の移植を評価することができます。
Abstract
過去10年間の間に、幹細胞移植は、病気、前臨床および臨床試験の両方の様々なプライマリまたはセカンダリの治療法として注目を集めています。しかし、機能的転帰、および/または組織再生、次の幹細胞移植に関する結果を最新の状態には非常に多様である。一般的に、臨床的利益は、基礎となるメカニズム(S 1)の深遠な理解せずに観察される。したがって、複数の努力が正確に移植した幹細胞及び/又はそれらの微小環境の生存、運命学と生理学を評価するための究極の目的とした移植幹細胞を監視する別の分子イメージングモダリティの発展につながっている。分子イメージングによって決定される1または複数のパラメータで観察された変化は観察され、臨床効果に関係している可能性があります。この文脈において、我々の研究は、生物発光イメージングの併用(BLI)、磁気共鳴イメージング(MRI)や組織学的analysiに焦点を当てる移植幹細胞を評価するための。
BLIは、一般的に(ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞は、その基板の光は、次の相互作用を放出することができる生化学的反応に基づいて、非侵襲的に細胞の追跡を行い、移植2月7日以下の時間での細胞生存率を監視するために使用されます例えば、D-は、ルシフェリン)8、9。一方、MRIは10、臨床的に適用される非侵襲的手法であり、その感度は非常にMRI造影剤による細胞標識後に生成されたコントラストに依存しますが、正確には非常に高い分解能11月15日で細胞の移植を見つけるために使用することができます。最後に、事後組織学的分析は、最高の解像度と感度で非侵襲的手法で得られた研究成果を検証するための最適な方法です。また、エンドポイント組織学的分析は、Ba、私たちは移植した細胞および/または周囲の組織の詳細な表現型の解析を実行することができます蛍光レポータータンパク質および/または特異的抗体との直接的な細胞標識の使用上のSED。
要約すると、我々はここで視覚的に別の幹細胞および/または環境関連マウスの中枢神経系に移植幹細胞を次のような特徴を解明するためにBLI、MRIおよび組織の補完性を示しています。青色蛍光ミクロンサイズの酸化鉄粒子(MPIOs)は、グラフトされたされると遺伝的に強化された緑色蛍光タンパク質(EGFP)とホタルルシフェラーゼ(fLuc)を発現するように設計、および標識された例として、骨髄由来のストローマ細胞、免疫有能なマウスと結果のCNS は、BLI、MRIと組織像( 図1)によって監視されます。
Protocol
1。細胞調製
- 実験は、遺伝的にルシフェラーゼ及びEGFPレポータータンパク質を発現するように設計ex vivoで培養された幹細胞集団を使用して開始する必要があります。ここでは、前述のBergwerf ら 2、図5によって説明/ルシフェラーゼのeGFPを発現するマウス骨髄由来ストローマ細胞(BMSC-Luc/eGFP)を使用します。
- 1μg/ mlのPuromycineを添加した15ミリリットルの完全増殖培地(CEM)のT75培養フラスコごとに8×10 5細胞の密度で細胞標識、プレートBMSC-Luc/eGFP細胞の二日前。
- 細胞は℃、5%CO 2で37 48時間成長することができます。
- 成長細胞培養(:T75培養フラスコに15 mlの培養液あたり75×10 6粒子の合計)に5×10 6氷河ブルーミクロンサイズの酸化鉄粒子(GB MPIO)ml当たり培地を追加します。
- エンドサイトーシスを介した粒子の取り込みを可能にするために16時間インキュベートします。
- 残りの粒子を洗い流すそして細胞はギガバイトMPIOの細胞コンフルエントと均一な分布を得るためにさらに24時間のために成長することができます。
- のeGFP +細胞の総量のeGFP +およびGB MPIO +細胞の割合をカウントすることにより、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に粒子の取り込みを検証します。
- トリプシン-EDTA処理(5分間T75培養フラスコあたり5 ml)の後10 mlのPBSと収穫細胞を二回ギガバイトMPIO標識BMSC-Luc/eGFP細胞を洗浄します。
- 採取した細胞を洗浄し、PBSで133×10 6細胞/ mlの最終濃度で再懸濁します。
- 移植まで氷上で細胞を維持する。
2。マウスの中枢神経系における細胞移植
- ケタミンの腹腔内注射(80 mg / kg体重)+キシラジン(16 mg / kg)を混合することによってマウスをAnaesthetize。
- マウスは眠りに落ちるようにする5分間待ちます。
- 無菌操作を可能にするために、マウスの頭を剃る。
- 定位フレームにマウスを置きます。
- Desinfect皮膚や脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らす。
- 頭蓋骨を露出させる正中頭皮の切開を行い、与えられた座標に歯科用ドリルバリを使って頭蓋骨に穴ドリル:後部2ミリメートルとブレグマに横方向の2ミリメートルです。
- 簡単に渦細胞懸濁液を、シリンジで細胞懸濁液を吸引除去する。
- 硬膜の下に2.5mmの深さに注射針を置き、1分間の圧力平衡を可能にします。
- 自動マイクロインジェクションポンプを用いて、硬膜下2mmの深さで、0.70μL/ minの速度で3μlの細胞懸濁液(4×10 5細胞)を注入します。
- 注入された細胞懸濁液の逆流を防ぐために、さらに5分間待ちます。
- 徐々に針を撤回し、皮膚を縫合する前に、皮膚の境界線を消毒する。
- 脱水を防ぐために、皮下に300μlの0.9%NaCl溶液を注入し、麻酔から回復するための加熱ランプの下にマウスを置きます。 pを管理OST-手術機関の規格に準拠した鎮痛剤。
(3)in vivoでの生物発光で
- イソフルランと酸素の3%の混合物でマウスをAnaesthetize。
- フォトンイメージャーでマウスを配置し、イソフルランと酸素1.5%に麻酔レベルを減らすことができます。
- 静脈内に体重kg当たり150 mgのD-ルシフェリンを注入します。
- 写真Visionソフトウェアを使用して、5分間の画像を取得します。
- M3visionソフトウェアを使用して画像処理を実行します。興味の固定領域を使用して観測信号を定量化する。
(4) 生体磁気共鳴イメージング
- N 2 O(3:7):O 2の混合物中のイソフルラン3%のマウスをAnaesthetize。
- 水平方向の9.4T MRシステムの制止にマウスを置き、O 2の混合物中のイソフルラン1%に麻酔レベルを低減:N 2 O(3:7)。
- 脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らするには、マウスの腹の下にセンサーを配置することによって、体温をモニターし、呼吸数を監視するために直腸プローブを接続します。
- 110±1分あたり10回の呼吸で呼吸を維持し、±0.5 37℃の狭い範囲内で体温を一定に保つ
- マウスヘッドとの位置磁石の中央にマウスの上に表面RFコイルを配置します。
- 70μmの2の面内分解能を持つ幹細胞の移行を検討するために、特定の解剖学的情報を得るための10の冠状T2強調スピンエコー(SE)のイメージのセットを取得し、T2 *強調グラディエントエコー(GE)の画像。次のように配列パラメータを設定します。繰り返し時間(TR):500ミリ秒、エコー時間(TE):8ミリ(GE系列)と繰り返し時間(TR):4200ミリ秒、エコー時間(TE):12.16ミリ秒(SEシーケンス)。視野(FOV):18×18 mm 2で 、マトリクス:256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離(Paravision 5.1ソフトウェア)。
- データ処理を実行します。アミラ4.0ソフトウェアを使用します。
5。死後組織学
- イソフルラン(4%)、酸素(0.5 L / min)と窒素(1 L / min)で2分間混合物の吸入により、非常に深くマウスをAnaesthetize。頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。
- 頭蓋骨から、マウスの脳を取り出して、2時間PBS中4%パラホルムアルデヒド中で脳組織を固定。
- スクロースの異なる勾配で続いて脳を配置することによって、脳組織を脱水:PBS中20%スクロース中で一晩、PBS中の10%ショ糖でPBS、2時間で5%スクロース、2時間。
- 液体窒素を用いて脳組織を凍結し、切片まで-80℃で組織を格納します。
- クライオスタットを用いて厚さ10μmのセクションのセクション脳組織。
- 画面はGB MPIO粒子と蛍光顕微鏡を用いたeGFPを発現する細胞からの緑色蛍光から青色蛍光のために凍結切片を無染色。
- 画面には、のために凍結切片を無染色炎症性細胞からの赤/緑バックグラウンドの蛍光。
- 携帯移植と相互作用する内因性の細胞集団(例えば、ミクログリア、アストロサイト、T細胞、...)を識別するために、さらに免疫組織化学的および免疫蛍光染色を行います。
6。代表的な結果
ここでは視覚的にマウスの中枢神経系におけるルシフェラーゼ/ EGFPを発現する(幹)細胞集団の成功したマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適な順序を提示した。最初に、簡単に検証することができますBMSC-Luc/eGFP細胞の非常に効率のよいラベリングに記載さギガバイトMPIOラベリング手順の結果は、蛍光顕微鏡( 図2A)を使用します 。マウスの中枢神経系にBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた次の、GB MPIOの移植時に、細胞の移植片の生存率はルシフェラーゼ活性( 図2B)に基づいて生体内 BLI で監視することができます。さらに、移植細胞の正確な局在は、 生体内で監視することができます図2C)の鉄含有量に基づいています。最後に、組織学的分析は、BLIとMRIにより得られた結果の検証を可能にします。安定した生存率は時間内に安定したEGFP発現( 図2D)により確認された。このためには、青色蛍光MPIOとのeGFP発現細胞の局在は、ローカリゼーションと移植した細胞の生存率の正確な測定が可能になります。さらに、幹細胞のこの二重蛍光標識は、5炎症性細胞によって作成されたバックグラウンドの蛍光に基づいて、偽陽性の結果を観察する可能性を減らすことができます。
図1処理シーケンスの概要
- 細胞標識:BMSC-Luc/eGFPはmlの培養液あたり5×10 6ギガバイトMPIO粒子で標識されています。インキュベーション、24時間以下の残りの期間の16時間後、細胞をのために収穫される脳内注入。
- 細胞移植:ブレグマ-2 mmで硬膜下の正中線と2 mmから2 mmの右:GB MPIOはBMSC-Luc/eGFPは、次の座標にマウスの脳に移植されているラベル。
- 生体 BLI の場合 :150 mgのD-luciferin/kg体重以下の静脈内投与は、生成された光は、フォトンイメージャを使用して5分の間に買収されました。
- 生体内 MRI で 70μmの2の面内分解能10コロナのT2強調スピンエコー(SE)の画像とT2 *強調グラディエントエコー(GE)の画像のセットが取得された。シーケンスパラメータは以下の通りであった繰り返し時間(TR):500ミリ秒、エコー時間(TE):8ミリ(GE系列)と繰り返し時間(TR):4200ミリ秒、エコー時間(TE):12.16ミリ秒(SEシーケンス)。視野(FOV):18×18 mm 2で 、マトリクス:256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離。
- 事後組織:10μmの厚さの凍結切片を発現しているEGFPおよび青色蛍光標識されたBMSC uのためのスクリーニングを行った蛍光顕微鏡を歌う。
図2幹細胞移植のマルチモーダルイメージング
- 氷青(GB)MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの直接免疫蛍光顕微鏡検査法。
- 4×10 5ギガバイトMPIOを注射したマウスの in vivo BLI で移植後1週と2週目BMSC-Luc/eGFP細胞を標識した。第1週と2週後の移植で検出されたBLI信号の統計的分析。データは5分の期間から平方センチメートル当たりステラジアンあたりの毎秒の光子数の平均値(PH / S / SR / cm 2)のように表される+ / -クリアBLI信号を示すマウスに関心の固定領域から計算された標準誤差注射部位。
- コロナの二次元ギガバイトMPIOのMRIラベルBMSC-Luc/eGFP(左のパネルは、(i)T2強調スピンエコー画像と、(ii)T2 *強調グラディエントエコー画像)とBMSC-Lラベルが付いていないUC / EGFP(右パネル:(III)T2強調スピンエコー画像、および(vi)T2 *強調グラディエントエコー画像)をマウス脳に移植。
- ギガバイトMPIOの組織学的解析では、2週後の移植でBMSC-Luc/eGFPインプラントを標識した。 eGFPを発現し、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFP移植のローカライズは、(i)直接免疫蛍光分析。 (ii)の高倍率の詳細(I)。 (ⅲ)GFAP抗原に対する免疫蛍光染色、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの周囲のアストロサイトの瘢痕組織の発展を示す。ギガバイトMPIOのIBA-1抗原、侵略を示すと周囲のために(VI)の免疫蛍光染色は、ミクログリアによってBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた。
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Discussion
本稿では、免疫有能なマウスの中枢神経系の細胞のインプラントの詳細な特性のための3つの相補的なイメージングモダリティの組み合わせ(BLI、MRIおよび組織)のために最適化されたプロトコルを記述します。レポーター遺伝子ルシフェラーゼ及びEGFP、およびGB MPIOとの直接的な細胞標識と遺伝的改変に基づく細胞のレポーター遺伝子標識の組み合わせは、in vivoで幹細胞移植の正確な評価につながります。
アニオン性表面(カルボキシル代替)との組み合わせでBMSCの粒子ラベリング、GB MPIO粒径(1.63μm)のために16から18の非貪食細胞によるこれらの粒子のエンドサイトーシスの取り込みを容易にするために提案されている。しかし、それは高い標識効率を得るためのインキュベーション時間は細胞の種類に依存することに言及する必要があります。例えば、貪食細胞(マクロファージや樹状細胞など)をより迅速に、これらの粒子を内部化することができます(0.5のインキュベーション時間 - 1時間)効率のよいラベリングには最低限16時間のインキュベーション時間を必要とする非phaghocytic種類の細胞(BMSCまたは神経幹細胞など)に比べて。これは、細胞標識実験とラベリングの効率化を実行中に常に蛍光顕微鏡および/またはフローサイトメトリー分析を使用して事前に決定されるべきである考慮する必要があります。ギガバイトMPIOsで細胞集団の標識と細胞の生存、細胞増殖や細胞の表現型5に影響を与えないように、これらの粒子中の酸化鉄と蛍光体の組み合わせは、したがって、両方のMRIや光イメージングによってそれらを視覚化するための理想的な機会を作成します。また、高鉄の含有量と大きな粒径のために、MPIO粒子は、単一のセル12,19,20及びMRIによる単粒子イメージング21に使用することができます。それは、単一細胞を観察することができるように細胞遊走を勉強するとなるとこれは非常に興味深いものです。ただし、使用ギガバイトMPIOの高い鉄含有量MRIによる移植部位の正確なサイズを記述するために目的とする場合、粒子はまた、特定の欠点があります。 MPIOsの非常に高い鉄の含有量は、インプラントサイトのボリュームと移植細胞と周囲組織との間の精度が低く差別の過大評価、その結果、インプラントのサイトではなく、細胞のインプラントの周囲に磁性不均一性を作成するだけでなく。その結果、粒子の種類は、細胞標識に必要な、研究デザインによって異なります。幹細胞の移行を決定することを目指したとき、MPIOsを含む非常に高感度と高いため、鉄が必要になります。一方、低い鉄含有量を有する幹細胞移植、小さいSPIOsの正確な局在を目指したときには、望ましい代替22かもしれません。また、鉄粒子は、移植細胞と出血以下の細胞移植の間に差別に関する別の問題を導入する負のコントラストを生成します。したがって、多くの研究が起こっている細胞標識のために肯定的な造影剤の使用に向かって上に。粒子の種類の横に、MRI取得のために使用するシーケンスのタイプも研究の目的に依存します。それは高精度に解剖学的情報を提供するとして、インプラントの位置とインプラントボリューム上の正確な情報を得るためにインプラントを区切るために使用されている場合MRI、T2シーケンス(スピンエコー)が有利である。一方、T2 *シーケンス(勾配エコー)は、このシーケンスは磁場のすべての不均質性は、磁場に影響を与える化合物に対して高い感度をレンダリングを考慮したとして、移植細胞の可能性への移行を検討するために使用されるシーケンスです。それは注入領域の外に移行しているかもしれない細胞の少量の検出に来るときは、このシーケンスは、絶対に必要である。このシーケンスを用いて、我々はBMSC-Luc/eGFP細胞がマウスの中枢神経系における線条体移植後移行しないと結論することができました。
一方、MRIは、細胞移植のローカライズに関するデータを提供し、追加のBLIの分析は、細胞移植の生存2,4,11に関するデータを提供します。ルシフェラーゼ酵素と基質ルシフェリンとの間の酵素反応は、O 2とATPの存在を必要とするとして、それは細胞の生存を勉強するための信頼性の高い手法である。壊死細胞はルシフェラーゼ酵素としないO 2を発現しないし、ATPが存在することになります。また、ルシフェラーゼ酵素を発現する細胞のみが技術の高感度に似ている光の生産、その結果、反応を触媒することができます。生成される光の量はルシフェラーゼを発現する細胞の量と比例するので、BLIは、定量的に行うことができます。しかし、重要な考慮事項は、細胞の量以外に、いくつかの要因は、ルシフェラーゼの発現レベルまたは検出された光の量に影響を与えることができるように定量的にBLIを実行する際に考慮する必要があります。たとえば、anesthesiレベルは、ルシフェラーゼ酵素及び/又はルシフェリンの可用性23に影響を与えることができ、さまざまな要因との化合物は、信号出力の違い、その結果、基板の可用性、および/ または摂取24から26またはプロモーター活性が27から30に影響を与えることができます。技術は、光の少ない組織への浸透が制限されているため、さらに、BLIの使用は、小さな動物に制限されています。その結果、移植後の細胞生存率をフォローアップするために定量的なBLIを実行することを目指したとき、おそらく信号の変動に影響を与えるすべてのパラメータは、可能な限り標準として保持する必要があります。例えば、細胞移植、麻酔レベルと投与経路/ BLIの取得前に投与された基質の量は、動物の皮膚の適切なシェービングなどの注入深さ
分子イメージングの説明した利点と欠点上記を考慮し、得られた結果は、常に組織学的分析によって検証する必要があります。ここにバリオ異なる種類の細胞の間に私達の細胞の表現型と細胞の相互作用は死後最高の感度で可視化することができます。これは偽陽性の結果につながる可能性があるとして、この手法は、選択の検証ツールであるという事実にもかかわらず、周囲および/またはグラフトサイトに侵入し、炎症細胞によって作成されたバックグラウンド蛍光の存在は、考慮する必要があります。しかし、このようなギガバイトMPIOなどのeGFPの蛍光レポーター遺伝子、および蛍光プローブとの二重標識の使用は、誤認の可能性(すなわち、移植細胞は無関係光の中でバックグラウンド蛍光を表示せずに、両方とも特定の螢光を表示する必要がありますが減少チャネル)。
要約すると、BLIは非常に高感度が低解像度で定量的に時間内に、細胞の生存を監視するためのユニークな手法であるが、MRIはBLIで得られた低解像度を克服するための最適な手法である。 生体テクニでこれらの組み合わせQUESは、非侵襲的in vivo で移植した細胞の生存とローカライズに関する十分な情報をレンダリングします。最後に、周囲の組織および/または内因性の炎症性細胞と細胞の移植の相互作用を簡単に組織を使用して事後監視することができます。現時点では、後者はまだ組織学的分析によって行われる必要がありますが、今後の主な課題は、使用して得られたと同様の分解能と感度でのパラメータのリアルタイム評価を可能にするために生体内分子イメージングモダリティで既存のを改善することになります組織学的分析。
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Disclosures
著者らは、利害の衝突を宣言しません。
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
IMDM | Lonza Inc. | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
Horse serum | GIBCO, by Life Technologies | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
Puromycine | Invitrogen | ant-pr-1 | |
trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
D-luciferin | Promega Corp. | E1601 | |
Ketamine (Ketalar) | Pfizer Pharma GmbH | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer AG | ||
Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
0.9% NaCl solution | Baxter Internationl Inc. | ||
paraformaldehyde | Merck & Co., Inc. | 1.04005.1000 | |
sucrose | Applichem | A1125 | |
Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
Photon imager | Biospace Lab | ||
9.4T MR scanner | Bruker Corporation | Biospec 94/20 USR | |
BX51 microscope | Olympus Corporation | BX51 | |
Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
syringe | Hamilton Co | 7635-01 | |
30 gauge needle | Hamilton Co | 7762-03 | |
Photo Vision software | Biospace Lab | ||
M3vision software | Biospace Lab | ||
Paravision 5.1 software | Bruker Corporation | ||
Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
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