Plus rapide, à haute résolution, la MTPA-GFP basée sur Fusion test mitochondrial l'acquisition de données cinétiques de plusieurs cellules en parallèle en utilisant la microscopie confocale

Summary

De fusion mitochondriale a été mesurée par le suivi de l'équilibrage de photoconverted matrice ciblée GFP à travers le réseau mitochondrial au cours du temps. Jusqu'à présent, une seule cellule pourrait être soumis à une analyse cinétique à long heure à une heure. Nous présentons une méthode qui permet de mesurer simultanément plusieurs cellules, ce qui accélère le processus de collecte de données.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Préparation plaque image Culture Ins1 cellules RPMI contenant 10% sérum de veau fœtal norme, 1% de pénicilline-streptomycine, 2 mM de L-glutamine, 50 uM de 2-mercaptoéthanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM d'HEPES, 2 mM d'acide pyruvique, et 11 mM de glucose à 80% de confluence. Trypsiniser les cultures de cellules Ins1 avec de la trypsine 0,05% et la plaque-les sur la poly-D-lysine plaques revêtues d'imagerie lamelle à fond (% de confluence 30-40). Autoriser pour les plaques pour atteindre la confluence de 60-80% (environ 2 jours) et ajouter de la matrice mitochondriale ciblé (COXVIII) adénoviral PA-GFP pendant 24 heures (MOI = 5). Les médias de change et permettent aux cellules de croître pendant encore 2 jours avant l'imagerie. Le jour de l'imagerie, ajouter 7-15 TMRE nM à des plaques d'imagerie, et s'équilibrer pendant au moins 45 min. Durant ce tour de temps sur l'incubateur (étage supérieur incubateur a été utilisé ici) et permettre le microscope à s'équilibrer à 37 ° C pendant environ 1 heure. Allumez le 5% de CO 2. </li> 2. Paramètres d'imagerie pour l'Zeiss LSM 710 Microscope confocal Après le microscope a équilibré, sous l'onglet Acquisition, cliquez sur "outils" manuel montrent, ouvrez l'imagerie mis en place un groupe spécial, et choisissez "mode de canal" et passer le suivi de chaque "frame". Dans le panneau trajet de la lumière, choisissez LSM et le mode de canal. De travail de l'icône vers le haut spécimen, sélectionnez "arrière", MBS 690 +, et MBS 488. Au bas du panneau, choisissez "T-PMT" pour permettre la visualisation du champ lumineux ou d'un canal DIC. Terminer le réglage des paramètres de chemin de lumière en définissant la plage pour le colorant GFP à 490-540 nm et 580-700 nm pour à la teinture TMRE. Dans le mode d'acquisition, d'utiliser un 512 × 512 pixels champ de balayage, 4x moyenne, et choisissez un facteur de zoom (que vous pouvez vouloir garder cohérente à des fins d'étalonnage). 3. Optimiser les paramètres d'imagerie Utilisation de la apochromatique plan de 100x (1,4 NA) objectif, focnous sur vos cellules avec la lumière halogène, pas une lumière fluorescente, pour protéger les mitochondries de phototoxicité. Écran pour PA-GFP cellules exprimant l'aide d'un sténopé ouverture maximale et la numérisation pour trouver les cellules qui sont plus lumineux vert. Trouver la plus faible puissance du laser 2-photons nécessaire pour activer le PA-GFP et d'optimiser les paramètres d'imagerie veillant à ce que le signal ne sature pas le détecteur. Vérifiez que le signal PA-GFP co-localise avec le signal TMRE pour quelques z-series. La perte du signal TMRE indique dépolarisation mitochondriale ou de la phototoxicité, et les cellules présentant ces caractéristiques ne doivent pas être utilisés pour l'analyse. Trouver une cellule PA-GFP exprimer et de spécifier un facteur de zoom. Définissez la plage de la série Z de recueillir 6 tranches (cette gamme aura besoin pour satisfaire l'ensemble des 10 cellules, sauf si un particulier z-focus est défini à chaque position). Enregistrer la méthode d'imagerie, pour chaque cellule (cellule 1, cellule 2, etc). 4. Réglez le AutomatePortion d du Programme et de désigner les 10 cellules que vous suivrez pour le dosage de 1 heure Fusion mitochondriale Sur le panneau gauche de la fenêtre MultiTime, sélectionnez l'option "économie" du panneau, et spécifiez l'emplacement où les fichiers seront sauvegardés. Dans l '"acquisition" du panneau, de charger la méthode d'acquisition enregistrés pour la cellule 1 dans la configuration de numérisation et cochez la case pile z. Vous pouvez aussi choisir "marqué Z-milieu de pile z". Dans le "blocs" du panneau, sélectionnez "seul bloc à chaque endroit». Cliquez sur "ajouter" pour les blocs de chaque intervalle à mesurer. Dans le "timing" du panneau, sélectionnez "attendre l'intervalle" et tapez "0" dans le "délai d'attente avant le bloc au premier emplacement seulement". Blocs 2-4 aura "15 min" dans cette section. Dans le panneau Emplacement, choisissez "déplacer le focus pour charger la position entre les emplacements" et "charge numériser config quand« passer à loc »ou« la prochaine loc 'cliqué. Dans le cadre du "endroits Modifier la liste" choisir "effacer tout", puis sélectionnez «multiple endroits motorisé stade ". Under la "Bleach" panel, cliquez sur le "blanchiment" boîte, et de désigner le fichier de configuration dans le répertoire "config" dans le menu déroulant, tel que désigné dans la fenêtre principale du logiciel. Puis, dans le "blanchiment" fenêtre, enregistrer la méthode appropriée photoactivation. Dans le panneau régions, choisissez le retour sur investissement pour cette cellule particulière, et d'ajouter cette ROI à l'MultiTime en choisissant "add région actuelle à la liste ROI" fenêtre. Veillez à sélectionner l'emplacement même dans le "ROI" dans le menu déroulant. Pour le moment pour fonctionner correctement et pour chaque cellule d'avoir un intervalle de 15 minutes, deux méthodes ont besoin d'être sauvé. Dans la liste des blocs, le premier aura la configuration «réel» photoactivation, et le reste aura une "maquette" de configuration qui n'utilise pas le laser à deux photons. Le premier bloc sera également le seul bloc qui n'a pas de retard (BKIntv = 0). Par conséquent, la méthode commence par un balayage de base, suivie d'une analyse photoactivation. Le reste des blocs ont une 900 sec BkIntv, età chaque point temporel, il ya deux balayages comme au temps 0 s, afin de maintenir la cohérence de synchronisation. Pour chacune des 10 cellules à suivre au fil du temps, d'effectuer cette séquence: Trouvez une cellule exprimant PAGFP-sauver sa méthode d'imagerie Lieu panneau marquer la position stade, préciser la méthode d'imagerie Principal ROI panneau choisir une région d'intérêt à Bleach photoactivé panneau enregistrer un retour sur investissement spécifique et de le charger dans la boîte de retour sur investissement: Effacer le retour sur investissement et de réinitialiser le zoom de balayage à 1 Trouvez la cellule suivante et régler le zoom Répétez le processus pour les 9 prochains cellules Vérifiez que chaque emplacement scène et tous les blocs ont la méthode d'imagerie appropriée (scanner de configuration) associé. Assurez-vous également que le premier bloc à chaque endroit correspond à la méthode appropriée photoactivation tandis que le reste contenir une "maquette" méthode. Enfin, sélectionnez «Exécuter». 5. Analyser l'intensité du signal PA-GFP <li> Pour les cellules dans lesquelles le signal photoactivable-GFP co-localise avec le signal TMRE rouge, il faut soustraire le fond dans les images PAGFP (ici nous utilisons metamorph). Puis exporter les données vers Excel et calculer l'intensité moyenne de z-piles à chaque instant. Supprimer sections optiques qui n'ont pas de signal. Mesurer la dilution du signal dans chaque z-pile en calculant le pourcentage du signal original photoactivé. Chaque point de données est numérisé et enregistré deux fois, résultant en double z-stack informations pour chaque point dans le temps. Vérifier que les valeurs z-stack d'accord. Si ce n'est pas, ce qui est révélateur d'un problème (par exemple la cellule accent mouvement,). 6. Les résultats représentatifs Lorsqu'un événement se produit la fusion entre une activé et non activé PA-GFP mitochondrie, l'intérieur de la matrice PAGFP mitochondriale mélange avec la matrice non marqué et devient diluée sur une grande surface, diminuant le signalintensité (figure 1A). Dans la cellule INS1, une diminution significative de l'intensité du signal se produit toutes les 15 minutes, jusqu'à ce que l'équilibrage de la fusion mitochondriale a été atteint (environ 1 heure). Notez que la cellule dans la figure 1B présente colocalisation presque complète de PA-GFP et les signaux TMRE. Dans ces essais une très faible concentration de TMRE (15 nM) est utilisé pour aider à cibler la photoactivation de PAGFP, et aussi pour surveiller la santé des cellules. Les cellules avec une abondance de mitochondries dépolarisée aura colocalisation incomplète de PAGFP et TMRE et ne doit pas être analysé, car cela indique soit la phototoxicité, ou des cellules dans un état de mourir. Le temps d'équilibrage pour la fusion mitochondriale est généralement de 1 h dans Ins1 cellules, quand ~ 15% du volume mitochondrial est activé. Parfois, même si une petite zone est éclairée, la plupart des mitochondries deviennent photoactivé en raison d'être hautement en réseau, dans ce cas de fusion plus difficile à détecter. D'autres types cellulaires peuvent présenter des temps d'équilibrage différents et devraient être testés à des intervalles plus courts et sur une plus longue période pour caractériser la dynamique mitochondriale. Pour inhiber la fusion mitochondriale, les cellules peuvent être placés dans un environnement lipotoxic. Il a été précédemment démontré que 0,4 mM de palmitate fragments mitochondries, et inhibe la fusion mitochondriale 9. Cet effet peut être vu dans la figure 2, où les mitochondries sont fragmentées, mais l'intensité du signal de l'mtPAGFP ne change pas autant que dans des conditions normales (Figure 1). Par conséquent, la dilution du signal PA-GFP est susceptible d'être due à la fusion mitochondriale plutôt que la fission. Dans les types d'autres cellules, nous vous suggérons d'utiliser d'autres moyens connus pour induire la fragmentation mitochondriale, comme faire taire OPA1 qui est nécessaire pour la fusion mitochondriale 14. Figure 1. </strong> dilution typique du signal PA-GFP après photoactivation au cours d'une épreuve de fusion mitochondriale. A. PA-GFP devient progressivement gradateur en raison d'événements de fusion mitochondriales conduisant à la dilution de la protéine sur une surface croissante comme on peut le voir sur ces images projetées de 6 sections optiques quantifié toutes les 15 minutes. B. TMRE avec le PA-GFP montre que les mitochondries sont actives et non dépolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 2. Fusion mitochondriale inhibée par 0,4 mM de palmitate diminue la dilution de PA-GFP. Projections A. de 6 sections optiques montrant mitochondries court avec une intensité de signal immuable au fil du temps. Colocalisation B. PA-GFP avec TMRE montre que les mitochondries ne sont pas depolarisée. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Cette méthode permet l'imagerie de près de 10 cellules à la fois, si l'acquisition se produit toutes les 15 minutes après photoactivation. Le nombre exact de cellules dépendra de la rapidité avec laquelle on est capable de localiser et de marquer les cellules exprimant mtPAGFP au sein de la boîte de culture, et comment on peut rapidement mettre en place tous les paramètres du logiciel. Pour l'automatisation le bon déroulement d'une couche même de cellules doit être utilisé parce que les désignés Z-stack marges s'appliquera pour toutes les cellules.

La taille de cette zone photoactivation initiale régira le temps d'équilibration. Pour être capable de mesurer la fusion mitochondriale, il est important de photoactiver seulement 10-20% du réseau, tels que la propagation du signal au reste du réseau peut être suivi dans le temps. Si elle est trop grande partie du réseau est photoactivé, il est possible que la fusion complète aura lieu trop rapidement, et l'événement ne sera pas capturé.

Un soin extrême doit être prise àajuster la puissance du laser du laser à deux photons ainsi que la concentration TMRE pour éviter phototoxicité qui conduit à une dépolarisation mitochondriale. Veiller à ce que le signal mtPAGFP co-localise avec le signal TMRE peuvent aider à évaluer la phototoxicité et la santé des cellules en général ^8,15. Illumination avec la lumière epifluoerescent devrait être évitée. Alors que la recherche de cellules exprimant mtPAGFP, le sténopé doit être au maximum ouvert pendant le balayage avec une excitation 488nm à faible puissance. Réglage de la puissance du laser à deux photons pour photoactiver assez PA-GFP pour mesurer le signal de plus de 1 heure, mais de ne pas saturer l'une des cellules peut être difficile ^8. Cependant, le temps devrait être consacré à cette étape parce que le programme d'optimisation automatisée est une fois commencé, il est fastidieux de l'arrêter, pour choisir d'autres cellules, et de reprendre.

Pour le contrôle qualité, l'acquisition d'un contraste d'interférence différentiel (DIC) image (ou lumière transmise) pour surveiller l'accent mis sur les cellules peuvent être trèsutile et aussi un bon moyen pour détecter les bulles formées dans l'huile d'immersion lors de la numérisation, ce qui arrive parfois à partir des mouvements de la scène.

Bien que l'utilisation de cette méthode mtPAGFP recueille des données sur le mouvement unidirectionnel de protéines de la matrice des mitochondries de mitochondries photoactivé à ceux qui ne sont pas étiquetés, il est concevable d'utiliser cette technique pour étudier les processus d'autres. Par exemple, fluorochromes spécifiques peuvent être fixés à des protéines membranaires d'observer leur mouvement spécifique lors d'événements de fusion, comme cela a été montré pour ABC-moi, la fusion de ce qui se produit sur ​​une échelle de temps différente du mélange de protéines de la matrice solubles ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss