Быстрее, высокое разрешение, млн. тонн в год-GFP на основе митохондриальной Анализ Fusion Приобретение кинетические данные нескольких ячеек в параллельный с помощью конфокальной микроскопии

Summary

Митохондриальная слияние измерялась путем отслеживания уравновешивания photoconverted матрицы ориентированных GFP через митохондриальную сеть с течением времени. До сих пор только одна клетка может быть подвергнут в течение часа кинетического анализа одновременно. Мы представляем метод, который одновременно измеряет несколько ячеек, тем самым ускоряя процесс сбора данных.

Abstract

Mitochondrial fusion plays an essential role in mitochondrial calcium homeostasis, bioenergetics, autophagy and quality control. Fusion is quantified in living cells by photo-conversion of matrix targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP) in a subset of mitochondria. The rate at which the photoconverted molecules equilibrate across the entire mitochondrial population is used as a measure of fusion activity. Thus far measurements were performed using a single cell time lapse approach, quantifying the equilibration in one cell over an hour. Here, we scale up and automate a previously published live cell method based on using mtPAGFP and a low concentration of TMRE (15 nm). This method involves photoactivating a small portion of the mitochondrial network, collecting highly resolved stacks of confocal sections every 15 min for 1 hour, and quantifying the change in signal intensity. Depending on several factors such as ease of finding PAGFP expressing cells, and the signal of the photoactivated regions, it is possible to collect around 10 cells within the 15 min intervals. This provides a significant improvement in the time efficiency of this assay while maintaining the highly resolved subcellular quantification as well as the kinetic parameters necessary to capture the detail of mitochondrial behavior in its native cytoarchitectural environment.

Mitochondrial dynamics play a role in many cellular processes including respiration, calcium regulation, and apoptosis^1,2,3,13. The structure of the mitochondrial network affects the function of mitochondria, and the way they interact with the rest of the cell. Undergoing constant division and fusion, mitochondrial networks attain various shapes ranging from highly fused networks, to being more fragmented. Interestingly, Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Charcot Marie Tooth 2A, and dominant optic atrophy have been correlated with altered mitochondrial morphology, namely fragmented networks^4,10,13. Often times, upon fragmentation, mitochondria become depolarized, and upon accumulation this leads to impaired cell function¹⁸. Mitochondrial fission has been shown to signal a cell to progress toward apoptosis. It can also provide a mechanism by which to separate depolarized and inactive mitochondria to keep the bulk of the network robust¹⁴. Fusion of mitochondria, on the other hand, leads to sharing of matrix proteins, solutes, mtDNA and the electrochemical gradient, and also seems to prevent progression to apoptosis⁹. How fission and fusion of mitochondria affects cell homeostasis and ultimately the functioning of the organism needs further understanding, and therefore the continuous development and optimization of how to gather information on these phenomena is necessary.

Existing mitochondrial fusion assays have revealed various insights into mitochondrial physiology, each having its own advantages. The hybrid PEG fusion assay⁷, mixes two populations of differently labeled cells (mtRFP and mtYFP), and analyzes the amount of mixing and colocalization of fluorophores in fused, multinucleated, cells. Although this method has yielded valuable information, not all cell types can fuse, and the conditions under which fusion is stimulated involves the use of toxic drugs that likely affect the normal fusion process. More recently, a cell free technique has been devised, using isolated mitochondria to observe fusion events based on a luciferase assay^1,5. Two human cell lines are targeted with either the amino or a carboxy terminal part of Renilla luciferase along with a leucine zipper to ensure dimerization upon mixing. Mitochondria are isolated from each cell line, and fused. The fusion reaction can occur without the cytosol under physiological conditions in the presence of energy, appropriate temperature and inner mitochondrial membrane potential. Interestingly, the cytosol was found to modulate the extent of fusion, demonstrating that cell signaling regulates the fusion process ^4,5. This assay will be very useful for high throughput screening to identify components of the fusion machinery and also pharmacological compounds that may affect mitochondrial dynamics. However, more detailed whole cell mitochondrial assays will be needed to complement this in vitro assay to observe these events within a cellular environment.

A technique for monitoring whole-cell mitochondrial dynamics has been in use for some time and is based on a mitochondrially-targeted photoactivatable GFP (mtPAGFP)^6,11. Upon expression of the mtPAGFP, a small portion of the mitochondrial network is photoactivated (10-20%), and the spread of the signal to the rest of the mitochondrial network is recorded every 15 minutes for 1 hour using time lapse confocal imaging. Each fusion event leads to a dilution of signal intensity, enabling quantification of the fusion rate. Although fusion and fission are continuously occurring in cells, this technique only monitors fusion as fission does not lead to a dilution of the PAGFP signal⁶. Co-labeling with low levels of TMRE (7-15 nM in INS1 cells) allows quantification of the membrane potential of mitochondria. When mitochondria are hyperpolarized they uptake more TMRE, and when they depolarize they lose the TMRE dye. Mitochondria that depolarize no longer have a sufficient membrane potential and tend not to fuse as efficiently if at all. Therefore, active fusing mitochondria can be tracked with these low levels of TMRE^9,15. Accumulation of depolarized mitochondria that lack a TMRE signal may be a sign of phototoxicity or cell death. Higher concentrations of TMRE render mitochondria very sensitive to laser light, and therefore great care must be taken to avoid overlabeling with TMRE. If the effect of depolarization of mitochondria is the topic of interest, a technique using slightly higher levels of TMRE and more intense laser light can be used to depolarize mitochondria in a controlled fashion (Mitra and Lippincott-Schwartz, 2010). To ensure that toxicity due to TMRE is not an issue, we suggest exposing loaded cells (3-15 nM TMRE) to the imaging parameters that will be used in the assay (perhaps 7 stacks of 6 optical sections in a row), and assessing cell health after 2 hours. If the mitochondria appear too fragmented and cells are dying, other mitochondrial markers, such as dsRED or Mitotracker red could be used instead of TMRE.

The mtPAGFP method has revealed details about mitochondrial network behavior that could not be visualized using other methods. For example, we now know that mitochondrial fusion can be full or transient, where matrix content can mix without changing the overall network morphology. Additionally, we know that the probability of fusion is independent of contact duration and organelle dimension, is influenced by organelle motility, membrane potential and history of previous fusion activity^8,15,16,17.

In this manuscript, we describe a methodology for scaling up the previously published protocol using mtPAGFP and 15nM TMRE⁸ in order to examine multiple cells at a time and improve the time efficiency of data collection without sacrificing the subcellular resolution. This has been made possible by the use of an automated microscope stage, and programmable image acquisition software. Zen software from Zeiss allows the user to mark and track several designated cells expressing mtPAGFP. Each of these cells can be photoactivated in a particular region of interest, and stacks of confocal slices can be monitored for mtPAGFP signal as well as TMRE at specified intervals. Other confocal systems could be used to perform this protocol provided there is an automated stage that is programmable, an incubator with CO₂, and a means by which to photoactivate the PAGFP; either a multiphoton laser, or a 405 nm diode laser.

Protocol

1. Подготовка Image Plate INS1 культуры клеток в RPMI среде, содержащей 10% стандартного фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллина стрептомицин, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 5 мМ NaHCO 3, 2 мМ HEPES, 2 мМ пировиноградной кислоты и 11 мМ глюкозы до 80% слияния. Trypsinize INS1 клеточных культур с 0,05% трипсина и пластины их на поли-D-лизин покрытые покровным дном изображения пластин (30-40 слияния%). Разрешить для пластин достичь 60-80% слияния (~ 2 дня) и добавить митохондриях целевых (COXVIII) аденовирусной PA-GFP в течение 24 часов (МВД = 5). Биржа средств массовой информации и позволяет клеткам расти в течение еще 2 дней до съемки. В день изображение, добавить 7-15 нм TMRE на изображение тарелки, и равновесие, по крайней мере 45 мин. За это время очередь на инкубаторе (стадия топ инкубатор был использован здесь), и позволяет под микроскопом, чтобы уравновесить до 37 ° С в течение около 1 часа. Включите 5% CO 2. </LI> 2. Параметры изображения Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии После того, как микроскоп имеет уравновешенный, по приобретению, щелкните на "шоу ручного инструмента», открыть изображение настроить панели и выберите "Режим канала" и перейти отслеживать каждый "кадр". В свете панель пути, выберите МНК и канальном режиме. Исходя из образца значок вверх, выберите "тыла", MBS 690 +, и MBS 488. В нижней части панели, выберите "T-PMT", чтобы включить визуализацию светлом поле или ДВС канала. Завершите настройки параметров источника света путь, установив диапазон красителей GFP в 490-540 нм и 580-700 нм для красителей TMRE. В приобретении режиме, используется 512 × 512 пикселей сканирование поля, средняя 4x, а также выбрать коэффициент увеличения (который вы можете сохранить последовательную для калибровки). 3. Оптимизация изображений Параметры Используя план апохромат 100x (1.4 NA) объектива, ФОКнам на клетки с галогенной лампы, а не дневной свет, чтобы защитить митохондрий фототоксичности. Экран для PA-GFP выражения клетки, используя максимально открытым отверстием и сканирование, чтобы найти клетки, которые являются ярким зеленым цветом. Найти самые низкие мощности 2-фотонов лазер для активации PA-GFP и оптимизации параметров изображения обеспечение того, чтобы сигнал не насыщают детектора. Убедитесь, что PA-GFP сигнал локализуется с TMRE сигнала в течение нескольких Z-серии. Потеря TMRE сигнал указывает митохондриальной деполяризации или фототоксичности, и клетки, обладающие этими характеристиками не должны использоваться для анализа. Найти PA-GFP выражение клеток и определить коэффициент масштабирования. Установите Z-серии диапазон собрать 6 ломтиков (этот диапазон необходимо, чтобы удовлетворить все 10 ячеек, если конкретный г-фокус устанавливается на каждую позицию). Сохранение изображений методом для каждой ячейки (ячейка 1 ячейка 2 и т.д.). 4. Отрегулируйте Автоматизацияг часть программы и назначает 10 клеток вы будете следовать за 1 час митохондриальной Анализ Fusion На левой панели multitime окне выберите "экономия" панели и указать место, где будут сохранены файлы. В "Приобретение" панель загрузки приобретение метод сохранен для сотовых 1 в конфигурации сканирования и установите флажок Z стека. Также выберите "отмечены Z-средний стек я". В "блоков" панель, выберите пункт "одного блока в каждой точке". Нажмите на кнопку "Добавить блоки" для каждого интервала должна быть измерена. В "времени" панель, выберите пункт "подожди интервал" и типа "0" на "ожидание интервала до блока на первом месте только". Блоки 2-4 будет иметь "15 минут" в этом разделе. В расположение панели, выберите "переместить фокус, чтобы загрузить положение между местах" и "нагрузки сканирование конфигурации, когда" перейти к LOC »или« следующий LOC "нажата. Под" редактировать список мест "выберите" удалить все ", а затем выберите" несколько местах моторизованных этапе ". Undэ "Bleach", нажмите кнопку "Bleach" поле и назначить файл конфигурации в "конфигурации" выпадающее меню, как это обозначено в окне основного программного обеспечения. Тогда, в "отбеливание" окно, сохранить соответствующий метод фотоактивации. В панели регионов, выбирать ROI для этой клетки, и добавить к ROI multitime, выбрав "Добавить текущую область ROI список" окна. Не забудьте выбрать и том же месте в "ROI" выпадающего меню. Для времени, чтобы работать должным образом, и для каждой ячейки, чтобы иметь 15-минутный интервал, два метода должны быть сохранены. В списке блоков, первый из которых будет иметь "реальный" фотоактивации конфигурации, а остальное будет "макет" конфигурации, которые не используют двухфотонного лазера. Первый блок также будет только блок, который не имеет задержку (BKIntv = 0). Таким образом, метод начинается с одного базового сканирования, а затем фотоактивации сканирования. Остальные блоки имеют 900 сек BkIntv ив каждый момент времени существует два сканирования так же, как во время 0 секунд, чтобы сохранить временные последовательности. Для каждой из 10 клеток, которым необходимо следовать в течение долгого времени, выполните следующую последовательность действий: Найти PAGFP выражения клеточной сохранить его изображение методом Расположение панели, отметьте положение этапе, указать метод визуализации Главная ROI-панели выбрать регион представляет интерес для фотоактивируемые быть Bleach-панели сохранить определенный ROI, а также загрузить его в поле ROI: Стереть ROI и сбросить сканирование зум 1 Найти следующую ячейку и установить масштаб Повторите эту процедуру для следующих 9 клеток Убедитесь, что каждой точке сцены и все блоки имеют соответствующий метод съемки (сканирование конфигурации) связаны. Также убедитесь, что первый блок на каждом месте, соответствующем методе фотоактивации а остальные содержат "макет" методом. Наконец, выберите "Выполнить". 5. Анализ PA-GFP интенсивности сигнала <lя> Для ячеек, в которых фотоактивируемых-GFP сигнал локализуется с красным сигналом TMRE, вычитания фона в изображениях PAGFP (здесь мы используем метаморфизма). Затем экспортировать данные в Excel и расчета средней интенсивности для Z-стеки в каждый момент времени. Отменить оптических срезов, которые не имеют сигнала. Измерьте сигнал разведение в каждом Z-Stack путем расчета доли оригинальных фотоактивируемые сигнала. Каждая точка данных сканируется и зарегистрировано в два раза, в результате чего в двух экземплярах Z-Stack информации для каждого момента времени. Убедитесь, что Z-Stack значения согласуются. Если нет, это указывает на проблемы (например, фокус, сотовые движения). 6. Представитель Результаты Когда событие происходит слияние между активированной и неактивированной PA-GFP митохондрии, PAGFP в митохондриях смешивается с немеченого матрица и становится разбавляется по большей площади, уменьшая сигналинтенсивности (рис. 1а). В камере INS1, значительное снижение интенсивности сигнала происходит каждые 15 минут, пока равновесие митохондриальной слияние было достигнуто (около 1 часа). Обратите внимание, что клетки на рисунке 1b показывает почти полное колокализации PA-GFP и TMRE сигналов. В этих тестах очень низкой концентрации TMRE (15 нМ) используется, чтобы помочь целевой фотоактивации PAGFP, а также для контроля здоровья клетки. Клетки с обилием деполяризованного митохондрий будет неполным колокализации PAGFP и TMRE и не должны быть проанализированы, потому что это указывает на фототоксичности, или клетки, в умирающем состоянии. Уравновешивание время митохондриальной слияния, как правило, 1 час в INS1 клеток, при ~ 15% от объема митохондриального активирована. Иногда, даже если небольшой площади горит, большинство из митохондрий стать фотоактивируемые из-за того, что взаимосвязано, и в этом случае дальнейшее слияние трудно обнаружить. Другие типы клеток могут проявлять разные времена равновесие и должны быть проверены на короткие промежутки времени и на более длительный период, чтобы охарактеризовать митохондриальной динамику. Для подавления митохондриального синтеза, клетки могут быть размещены в lipotoxic окружающей среды. Ранее было показано, что 0,4 мМ пальмитата фрагменты митохондрий, а также ингибирует митохондриальный слияние 9. Этот эффект можно увидеть на рисунке 2, где митохондрии фрагментированы, но интенсивности сигнала mtPAGFP не меняется, насколько при нормальных условиях (рис. 1). Таким образом, разведение PA-GFP сигнал может быть связана с митохондриальной слияние, а не деления. В других типах клеток, мы предлагаем использовать другие известные способы, чтобы вызвать фрагментацию митохондриальных, такие как глушители OPA1 которая необходима для митохондриальных слияния 14. Рисунок 1. </stroнг> Типичные разбавления PA-GFP сигнал после фотоактивации во время анализа митохондриального синтеза. А. PA-GFP становится все регулятор в связи с митохондриальной событий слияние приводит к размыванию белка на увеличение области, можно увидеть в эти проецируемого изображения 6 оптических срезов количественно каждые 15 минут. Б. TMRE с PA-GFP показывает, что митохондрии являются активными и не деполяризованной. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Митохондриальная слияние тормозится 0,4 ммоль пальмитата уменьшает размывание PA-GFP. A. Прогнозы 6 оптических срезов показывает короткий митохондрий с неизменной интенсивностью сигнала с течением времени. Б. колокализации PA-GFP с TMRE показывает, что митохондрии не деполяризованным. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Этот метод позволяет визуализации около 10 клеток на время, если приобретение происходит каждые 15 минут после фотоактивации. Точное количество ячеек будет зависеть от того, насколько быстро человек способен находить и отмечать mtPAGFP экспрессирующие клетки в культуре блюдо, и как быстро можно настроить все параметры программы. Для автоматизации гладко даже слой клеток должны быть использованы, поскольку назначенный Z-Stack поля будет применяться для всех ячеек.

Размер этой первоначальной площади фотоактивации будет регулировать равновесие времени. Для того, чтобы измерять митохондриального синтеза, важно photoactivate только 10-20% от сети, например, что распространение сигнала к остальной части сети можно контролировать с течением времени. Если слишком много сети фотоактивируемые, вполне возможно, что полное слияние будет происходить слишком быстро, и это событие не будет захвачен в плен.

Экстремальный необходимо позаботиться, чтобырегулировать мощность лазера в двухфотонного лазера, а также TMRE концентрации, чтобы избежать фототоксичности что приводит к митохондриальной деполяризации. Обеспечение того, чтобы сигнал mtPAGFP локализуется с сигналом TMRE может помочь в оценке фототоксичности и общее состояние здоровья ячейки ^8,15. Освещение с epifluoerescent света следует избегать. В поисках клеток, экспрессирующих mtPAGFP, отверстие должно быть максимально открытыми при сканировании с низким возбуждения 488nm власти. Регулировка двухфотонного лазерного власти photoactivate достаточно PA-GFP для измерения сигнала в течение 1 часа, но не oversaturate любой из ячеек может быть сложно ^8. Тем не менее, время должно быть потрачено в этом оптимизация шаг, потому что как только автоматизированная программа запущена, это утомительно, чтобы остановить его, чтобы выбрать несколько ячеек, и резюме.

Для контроля качества, получение дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображение (или проходящего света), чтобы контролировать фокус на клетки может быть оченьполезно, а также хороший способ обнаружить пузырьки образуются в масле погружение во время сканирования, это иногда случается с движениями на сцене.

Хотя с помощью этого метода mtPAGFP собирает данные о однонаправленного движения митохондриальные белки матрицы из фотоактивируемые митохондрий те, которые не обозначены, вполне возможно, использовать этот метод для изучения других процессов. Например, конкретные флуорохромами могут быть присоединены к мембранным белкам наблюдать за их конкретные движения во время слияния событий, как это было показано на ABC-мне, слияние, которое происходит на различных временных масштабах от смешивания растворимых белков матрицы ^15.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
COXIII-adenoviral PA-GFP	Dr. Lippincott-Schwartz
TMRE	Invitrogen	T669
Zeiss LSM 710 confocal	Zeiss