हम टी सेल विकास में विशिष्ट प्रतिजन चूहे टी लिम्फोसाइट लाइनों के इन विट्रो विस्तार के लिए इस्तेमाल किया कारक की तैयारी का वर्णन.
Abstract
प्रतिजन विशेष टी सेल संस्कृति में लाइनों या क्लोन के रखरखाव प्रतिजन प्रेरित सेल विस्तार 1,2 के चरणों द्वारा अलग सक्रियण के दौर की आवश्यकता है. 2 इंटरल्यूकिन के विस्तार के चरण के दौरान संस्कृति मीडिया के अलावा करने के लिए कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए आवश्यक है और अल्पकालिक टी सेल लाइनों को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है, लेकिन TH1 3 ध्रुवीकरण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है. 2 इंटरल्यूकिन की टी सेल विकास (TCGF) कारक है जो साइटोकिन्स का मिश्रण होता है द्वारा रिप्लेसमेंट अधिक 3 इन विट्रो में लंबी अवधि के टी सेल लाइनों को बनाए रखने में इंटरल्यूकिन दो से अधिक प्रभावी है. इसके अलावा, TCGF आसानी से प्रयोगशाला में बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और पुनः संयोजक 2 इंटरल्यूकिन की तुलना में बहुत सस्ता है.
यहाँ, हम बताते हैं कैसे चूहे splenocyte संस्कृति supernatants से TCGF तैयार करने के लिए. इस प्रक्रिया के लिए, हम भोले लुईस thymus और रक्त संग्रह के लिए euthanized चूहों से spleens फसल. हम तैयार spleens से एकल कक्ष निलंबन, आसमाटिक सदमे से लाल रक्त कोशिकाओं lyze, और बीज संस्कृति माध्यम में splenocytes. कोशिकाओं concanavalin एक, एक mitogen है कि गैर चुनिंदा सभी चूहे टी lymphocytes सक्रिय साइटोकिन्स का उत्पादन उत्प्रेरण के साथ प्रेरित कर रहे हैं. संस्कृति supernantant 48 घंटे बाद एकत्र andexcess concanavalin अल्फा मिथाइल mannoside के लिए बाध्य है यह टी सेल लाइनों जो TCGF जोड़ा जाएगा को सक्रिय करने से रोकने के. TCGF तो बाँझ फ़िल्टर, aliquoted, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
Protocol
लुईस चूहे spleens (160 200g के बीच चूहों सर्वोत्तम) ले लो. पीबीएस + (पीबीएस पी एस) एंटीबायोटिक दवाओं के एक सेल झरनी का उपयोग युक्त एक पेट्री डिश में बर्फ पर Dilacerate. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखो. पीबीएस – पुनश्च साथ भरें. 4 में 10…
Discussion
हम TCGF लुईस चूहे splenocytes से तैयार के बाद से हम नियमित रूप से यह सीरम और thymi इन विट्रो में लुईस चूहे टी सेल लाइनों को प्रोत्साहित करने के लिए फसल तनाव से अनुभवहीन चूहों euthanize. इस TCGF के लिए और अन्य चूहा उपभेदों से टी सेल लाइन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
PBS, 1x, sterile
Reagent
Gibco / Invitrogen
14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x
Reagent
Sigma
P0781
Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter
Tool
Fisher
08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)
Reagent
Sigma
A0171
Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640
Reagent
Gibco / Invitrogen
21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)
Reagent
Gibco / Invitrogen
16140-071
Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine
Reagent
Cambrex / Biowhittaker
17-718R
PSG
RPMI vitamins, 100x
Reagent
Sigma
R7256
Sodium pyruvate, 100x
Reagent
Sigma
S8636
Non-essential amino acids, 100x
Reagent
Sigma
Beta-mercaptoethanol
Reagent
Sigma
M7522
alpha methyl mannoside
Reagent
Sigma
M6882
Concanavalin A
Reagent
Sigma
M6882
To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.