La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Summary

Se describe la preparación del factor de crecimiento de las células T utilizados para la expansión in vitro de antígenos específicos de las líneas de linfocitos T de rata.

Abstract

Mantenimiento de antígeno específico de líneas de células T o clones de la cultura requiere rondas de antígeno de la activación inducida por separado por las fases de expansión celular ^1,2. Además de la interleucina 2 a los medios de cultivo durante la fase de expansión es necesaria para prevenir la muerte celular y suficiente para mantener a corto plazo líneas de células T, pero se ha demostrado que aumenta la polarización Th1 ^3. Sustitución de la interleucina 2 por el factor de crecimiento de las células T (TCGF), que contiene una mezcla de citoquinas es más eficaz que la interleucina 2 en el mantenimiento a largo plazo las líneas de células T in vitro ^3. Por otra parte, TCGF se pueden preparar fácilmente en grandes cantidades en el laboratorio y es mucho más barato que la interleucina 2 recombinante.

Aquí, se muestra cómo preparar TCGF a partir de sobrenadantes de esplenocitos de ratas cultura. Para este procedimiento, se cosecha el bazo de ratas Lewis ingenuo sacrificados por el timo y la extracción de sangre. Preparamos una sola célula suspensiones de los bazos, Lyze los glóbulos rojos por choque osmótico, y las semillas de los esplenocitos en medio de cultivo. Las células son estimuladas con concanavalina A, un mitógeno que no activa selectivamente los linfocitos T de rata, que induce la producción de citoquinas. El sobrenadante se recoge la cultura 48 horas más tarde andexcess concanavalina A se une a la alfa metil mannoside para evitar la activación de líneas de células T a la que se añadirá TCGF. El TCGF entonces esterilizada por filtración, alícuotas, y almacenadas a -20 ° C.

Protocol

Tome el bazo de ratas Lewis (ratas entre 160-200g son los mejores). Dilacerate sobre el hielo en un plato de Petri que contiene PBS + antibióticos (PBS-PS) con un filtro de la célula. Poner en un tubo de 50 ml. Rellenar con PBS-PS. Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células. Lavar las células dos veces. Resuspender el precipitado en NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por bazo). Mezclar suavemente y de forma continua con una pipeta de 3 minutos sobre el hielo para lisar …

Discussion

Preparamos TCGF a partir de esplenocitos de ratas Lewis ya que regularmente la eutanasia a las ratas ingenuo de esta cepa de la cosecha de suero y thymi para estimular Lewis rata líneas de células T in vitro. Este TCGF se puede utilizar para promover el crecimiento y la supervivencia de las líneas de células T a partir de cepas de ratas otros. TCGF también puede ser preparado a partir de otras cepas de ratas.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x	Reagent	Sigma	P0781	Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter	Tool	Fisher	08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Reagent	Sigma	A0171	Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640	Reagent	Gibco / Invitrogen	21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)	Reagent	Gibco / Invitrogen	16140-071	Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine	Reagent	Cambrex / Biowhittaker	17-718R	PSG
RPMI vitamins, 100x	Reagent	Sigma	R7256
Sodium pyruvate, 100x	Reagent	Sigma	S8636
Non-essential amino acids, 100x	Reagent	Sigma
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7522
alpha methyl mannoside	Reagent	Sigma	M6882
Concanavalin A	Reagent	Sigma	M6882

To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.