Förbereda T Factor Cell Tillväxt från Rat Splenocytes

Summary

Vi beskriver förberedelserna av T-cell tillväxtfaktor som används för in vitro-expansionen av antigen-specifika råtta T-lymfocyter linjer.

Abstract

Underhåll av antigen-specifika linjer T-cell eller kloner i kultur kräver rundor av antigen-inducerad aktivering separerade med faser av cellens tillväxt ^1,2. Tillägg av interleukin 2 till kultur media under expansionsfasen är nödvändiga för att förhindra celldöd och räcker för att hålla korta rader T-cell, men har visat sig öka Th1 polarisering ^3. Byte av interleukin 2 av T cell growth factor (TCGF) som innehåller en blandning av cytokiner är mer effektivt än interleukin 2 för att bibehålla långsiktiga linjer T-cell in vitro ^3. Dessutom kan TCGF enkelt beredas i stora mängder i laboratorium och är mycket billigare än rekombinant interleukin 2.

Här visar vi hur man förbereder TCGF från råtta splenocyte kultur supernatanterna. För detta förfarande, skördar vi mjälte från naiva Lewis råttor avlivas för bräss och blod samling. Vi förbereder encelliga suspensioner från mjälte, Lyze de röda blodkropparna genom osmotisk chock, och utsäde till splenocytes i odlingsmedium. Cellerna stimuleras med concanavalin A, en mitogen att icke-selektivt alla lymfocyter råtta T aktiveras, förmå produktionen av cytokiner. Kulturen supernantant samlas 48 timmar senare andexcess concanavalin A är bundet till alfa-metyl mannoside att förhindra den från att aktivera T-cellinjer som TCGF tillkommer. Den TCGF är då steril-filtreras, alikvoteras och förvaras vid -20 ° C.

Protocol

Ta Lewis råtta mjälte (råtta mellan 160-200g är bäst). Dilacerate på is i en petriskål med PBS + antibiotika (PBS-PS) med en cell sil. Sätt i en 50 ml tub. Fyll med PBS-PS. Spin i 10 min vid 4 ° C till pellets cellerna. Tvätta cellerna två gånger. Återsuspendera pelleten i NH 4 Cl 0,15 Mkr (5 ml per mjälte). Blanda försiktigt och kontinuerligt med en pipett i 3 min på is för att lysera erytrocyterna. Fyll röret med mediet. Spin i 10 min vid 4 ° C til…

Discussion

Vi förbereder TCGF från Lewis råtta splenocytes eftersom vi regelbundet euthanize naiva råttor från denna stam till skörd serum och Thymi att stimulera Lewis råtta T-cellinjer in vitro. Detta TCGF kan användas för att främja tillväxt och överlevnad av T-cellinjer från andra råtta stammar. TCGF kan också framställas av andra stammar av råttor.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PBS, 1x, sterile	Reagent	Gibco / Invitrogen	14040-182
Penicillin / Streptomycin 100x	Reagent	Sigma	P0781	Add 5 ml of 100x solution to 500 ml PBS to prepare PBS-PS
Cell strainer, 70 um diameter	Tool	Fisher	08-771-2
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Reagent	Sigma	A0171	Prepare a 0.15 M solution in sterile distilled water, keep cold
RPMI 1640	Reagent	Gibco / Invitrogen	21870-092
Fetal Bovine Serum (FCS, FBS)	Reagent	Gibco / Invitrogen	16140-071	Heat-inactivated
Penicillin / Streptomycin / L-Glutamine	Reagent	Cambrex / Biowhittaker	17-718R	PSG
RPMI vitamins, 100x	Reagent	Sigma	R7256
Sodium pyruvate, 100x	Reagent	Sigma	S8636
Non-essential amino acids, 100x	Reagent	Sigma
Beta-mercaptoethanol	Reagent	Sigma	M7522
alpha methyl mannoside	Reagent	Sigma	M6882
Concanavalin A	Reagent	Sigma	M6882

To prepare complete culture medium add the following to a 500 ml bottle of RPMI 1640 and sterile-filter: 10% FCS; 1 bottle of PSG; 5 ml RPMI vitamins; 5 ml sodium pyruvate; 5 ml non-essential amino acids; 50 uM beta-mercaptoethanol; 2 ug/ml Concanavalin A.