Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

Summary

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Abstract

Un contrôle précis de l'initiation et la progression ultérieure à travers les différentes phases du cycle cellulaire sont d'une importance capitale dans des cellules proliférantes. Cycle de division cellulaire est une partie intégrante de la croissance et la reproduction et la déréglementation des principaux composants du cycle cellulaire ont été impliqués dans les événements ayant mené à de ^1,2 cancérogenèse. Agents moléculaires dans les traitements anticancéreux fréquemment cibler les voies biologiques responsables de la réglementation et la coordination de la division du cycle cellulaire ^3. Bien que la cinétique du cycle cellulaire ont tendance à varier selon le type de cellule, la distribution des cellules parmi les quatre étapes du cycle cellulaire est plutôt cohérente au sein d'une lignée cellulaire particulière en raison de la tendance constante des mitogènes et d'expression du facteur de croissance. Événements génotoxiques et autres facteurs de stress cellulaire peut entraîner dans un bloc temporaire de la progression du cycle cellulaire, résultant en l'arrestation ou d'une pause temporaire dans une phase du cycle cellulaire en particulier pour permettre institutionstion du mécanisme de réponse appropriée.

La capacité à observer le comportement expérimentalement d'une population de cellules en fonction de leur stade de progression du cycle cellulaire est un progrès important dans la biologie cellulaire. Des procédures communes telles que mitotique secouer, centrifugation différentielle ou la cytométrie de flux à base de tri sont utilisées pour isoler des cellules à des stades spécifiques du cycle cellulaire ^4-6. Ces fractionnés, du cycle cellulaire en phase enrichis populations sont alors soumis à des traitements expérimentaux. Rendement, la pureté et la viabilité des fractions séparées peuvent souvent être compromise en utilisant ces méthodes de séparation physique. De plus, le laps de temps entre la séparation des populations de cellules et le début du traitement expérimental, dans lequel les cellules fractionnées peut progresser à partir du stade du cycle cellulaire sélectionnée, qui peuvent poser des défis importants dans la mise en œuvre réussie et l'interprétation de ces expériences.

D'autres approches de study stades du cycle cellulaire incluent l'utilisation de produits chimiques pour synchroniser les cellules. Le traitement des cellules avec des inhibiteurs chimiques des principaux processus métaboliques pour chaque stade du cycle cellulaire sont utiles dans le blocage de la progression du cycle cellulaire à l'étape suivante. Par exemple, les inhibiteurs de la ribonucléotide réductase hydroxyurée cellules s'arrête à la jonction G1 / S en limitant l'offre de désoxynucléotides, les blocs constitutifs de l'ADN. D'autres produits chimiques notables comprennent le traitement avec l'aphidicoline, un inhibiteur de l'alpha-polymérase d'arrêt G1, le traitement par la colchicine et le nocodazole, qui tous deux interférer avec la formation du fuseau mitotique à arrêter les cellules en phase M et enfin, le traitement avec la chaîne d'ADN de terminaison 5-fluorodeoxyridine pour initier arrestation de la phase S ^7-9. Le traitement avec ces produits chimiques est un moyen efficace de synchroniser toute une population de cellules à une phase particulière. Avec le retrait de la substance chimique, les cellules rejoindre le cycle cellulaire à l'unisson. Traitement de la libération test suivant l'agentde la composition chimique du cycle cellulaire de blocage assure que la réponse aux médicaments a suscité provient d'un uniforme, cycle cellulaire spécifique au stade de la population. Cependant, puisque la plupart des synchroniseurs chimiques génotoxiques sont des composés connus, à démêler la participation de diverses voies de réponse (aux synchroniseurs vs les agents de test) est un défi.

Nous décrivons ici une méthode de marquage métabolique pour la suite d'une sous-population de cellules activement à vélo à travers leur progression de la phase de réplication de l'ADN, par l'intermédiaire de la division et la séparation de leurs cellules filles. Couplé avec la quantification par cytométrie en flux, ce protocole permet à la mesure de la progression de cinétique du cycle cellulaire en l'absence de l'une des mécaniquement ou chimiquement induite par cellulaire souligne souvent associée à des méthodes autres cellules de synchronisation du cycle ^10. Dans les sections suivantes, nous allons discuter de la méthodologie, ainsi que certaines de ses applications dans la recherche biomédicale.

Protocol

1. Préparation des cellules Cellules de l…

Discussion

En combinant la cytométrie de flux avec l'incorporation de BrdU, nous avons les outils nécessaires pour étudier la cinétique du cycle cellulaire. La propriété distinctive de BrdU à fonctionner comme un analogue de la thymidine est ce qui permet de quantifier la teneur en ADN d'une cellule à vélo. L'incorporation de BrdU dans un brin d'ADN fille croissante au cours de la synthèse en phase du cycle cellulaire est ce qui permet un à suivre une sous-population de cellules à vélo à travers la r?…

Materials

Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
bromodeoxyuridine	Becton Dickinson	55089
propidium iodide	Sigma	287075	1mg/ml stock
FITC anti-BrdU	Becton Dickinson	347583
sodium tetraborate	Fisher	S80172	0.1M, pH 8.5
FACS Caliber	Becton Dickinson